禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫对鸭消化道抗体分泌细胞的影响.docx

1、南京农业大学学报2012,35(1):92-96JournalofNanjingAgriculturalUniversity王红丽，康海泓，杨倩.禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫对鸭消化道抗体分泌细胞的影响J.南京农业大学学报,2012,35(1):92-96禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫对鸭消化道抗体分泌细胞的影响王红丽，康海泓,杨倩.(南京农业大学动物医学院，江苏南京210095)摘要:为探讨鸭源禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫雏鸭的效果，应用鸭源禽流感灭活抗原与复合黏膜免疫佐剂(CpG和/或葡萄糖)饮水免疫推鸭，检测消化道(主要是咽和小肠)抗体分泌细胞的变化。首先分别从鸭的胆汁和血清中

2、粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,经纯化后制备了兔抗鸭IgA和IgG,然后应用免疫组化技术显示鸭消化道IgA和gG分泌细胞。试验结果表明:用禽流感灭活抗原配合Cp。和/或前萄糖饮水免疫后3、5和7周.消化道黏膜局部IgA分泌细胞面积均显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌细胞(除首免后第3和7周小肠外)极显著升高(P<0.01)。而单独用禽流感灭活抗原和用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫对消化道局部免疫水平影响不大。结论:鸭源禽流感灭活抗原配合免疫佐剂饮水免疫能够提高雏鸭消化道局部免疫水平。关键词：禽流感灭活抗原;饮水免疫;鸭;消化道;IgA分泌细胞;I

3、gG分泌细胞中图分类号:S858.32文献标志码:A文章编号：1000-2030(2012)01-0092-05EffectoforalimmunizationwithinactivatedavianinfluenzavirusandadjuvantontheantibodysecretingcellsinduckdigestivetractWANGHong-li,KANGHai-hong,YANGQian*(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity.Nanjing210095,China)Abstract:Inorde

4、rtoevaluatetheeflectsoforalimmunizationwiththeinactivatedavianinfluenzavirus(iAIV)vaccinewithadjuvantonducklings.TheareaofIgAandIgGsecretingcellsinthedigestivetract(mainlypharynxandsmallintestine)weredetectedafteroralimmunizationwithiAIVandadjuvantCpGwithorwithoutglucose.First,immunoglobulinA(IgA)an

5、dIgGwasisolatedfromduckbileandserumrespectively,andrabbitantiserumwasisolatedfrominoculatedrabbitsbypurifiedIgAandIgG.TheantibodysecretingcellswereshowedbySPA-HRPimmunohistochemicaltechnique.TheresultsshowedthattheareaofIgAandIgGsecretingcells(exceptforthe3rdand7thweekinsmallintestine)increasedsigni

6、licafitly(P<0.05orP<0.01)attheweeks3rd,5thand7thafteroralimmunizationwithiAIVandadjuvantCpGwith/withoutglucose.NosignificantchangeswerefoundintheducksimmunizedwithiAIVonlyoriAIVandglucose.Conclusion:theoralimmunizationwithiAIVtogetherwithadjuvantscoulddietlocalimmuneresponseinthedigestivetract

7、.Therefore,wespeculateditappearstobeefficaciousinsuppressingvirusreplicationandshedding.Keywords：inactivatedavianinfluenzavirus;oralimmunization;duck;digestivetract；IgAsecretingcells;IgGsecretingcells禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染性疾病。AIV的宿主范围广泛，能感染所有已知的畲类。以前一直认为鸭是AIV的贮存宿主。近几年鸭感染AIV发病和死亡的报道也越来越多。鸭感染禽流感后不仅发

8、病死亡，而且病毒可通过粪便污染环境，继而感染其他禽类和哺乳动物，因此控制水禽禽流感的发生具有重要的意义。A1V主要通过消化道和呼吸道感染鸭，而后在肠道黏膜复制。如果增强咽和小肠黏膜免疫力，阻止病毒经消化道和呼吸道途径进入体内，控制病毒在肠道定殖复制将会直接切断病毒的传播。目前控制和预防禽流感主要依靠注射禽流感全病毒灭活疫苗(油乳剂灭活苗)，但肌肉注射灭活疫苗不能对黏膜局部产生有效刺激，也就不能诱导局部免疫应答。研究表明黏膜免疫能够引起有效的黏膜免疫应答，口服弱毒疫苗可引起小肠黏膜中产生大量的IgA分泌细胞。口服灭活抗原是否可引起小肠黏膜中抗体分泌细胞数量增加目前还未见有报道。灭活A1V配合适当

9、的佐剂通过鼻腔免疫后局部呼吸道黏膜中产生较多的IgA分泌细胞*,由此，我们推测用佐剂配合灭活AIV饮水免疫会导致小肠收稿日期：2011-04-01基金项目：江苏省科技支撑计划项0CBE2OO83O155)；国家公益性行业(农业)科研专项(200803020)作者简介:王红丽，硕士研究生。.通讯作者:杨倩，教授，主要从事黏膜免疫研究，E-mail：zxbyq。黏膜中产生大量的抗体分泌细胞。家禽的消化道中分布有大量的淋巴细胞，其中IgA分泌细胞对防止病原微生物的入侵发挥重要的作用。分泌型IgA(secretorylgA,sIgA)是黏膜免疫应答过程中的主要效应因子,具有防止细菌、病毒与黏膜结合，中

10、和病原体等多种功能：4_51oslgA的合成过程如下：IgA分泌细胞先合成IgA，在通过黏膜上皮的过程中再与上皮细胞的分泌片(secretorycomponent,SC)结合形成slgA'6，在黏膜表面(口腔、消化道、呼吸道及泌尿生殖道黏膜)形成一层保护膜，构成防御病原微生物入侵机体的第一道屏障。因此，本试验选用鸭源禽流感H9N2灭活抗原与CpG配合，通过饮水方法来免疫雏鸭，检测消化道IgA和IgG分泌细胞数量的变化，以探讨灭活抗原饮水免疫对消化道局部黏膜免疫水平的影响，为饮水免疫法预防鸭感染禽流感提供理论基础。1材料与方法1.1试验动物及处理7日龄雏鸭100只随机分成5组，每组20只

11、。第1组用生理盐水(每只0.30mL)饮水免疫;第2组用鸭源禽流感灭活抗原(每只0.30mL)饮水免疫;第3组用鸭源禽流感灭活抗原配合葡萄糖(每只0.30mL)饮水免疫;第4组用鸭源禽流感灭活抗原配合CPG(每只0.30mL)饮水免疫;第5组用鸭源禽流感灭活抗原配合CpG和菊萄糖(每只0.30mL)饮水免疫。试验鸭由江南家禽育种有限公司提供，血清中均无禽流感和新城疫特异性抗体。鸭源禽流感灭活抗原由江苏省农业科学院提供，病毒毒株为H9N2亚型，抗原效价为1：1024,鸡胚半数致死量(ELDJlOmL-'o10日龄首次免疫，用注射器从口腔滴注；14日龄二次免疫,方法剂量与首次免疫相同。各组

12、分别于首次免疫后第3、5、7周宰杀取样,每次每组6只，均取咽部、小肠,Bouins液固定，常规石蜡切片,切片厚8皿。1.2鸭IgA和IgG的提取及兔抗鸭IgA和IgG血清的制备12.1鸭IgA的提取从刚宰杀的鸭胆囊中收集胆汁120mL,4T、10000g离心30min,取上清液加入等体积的50%饱和硫酸铉溶液，搅拌后于4幻过夜;次日4rJOOOOg离心30min,取上清液加人等体积的100%饱和硫酸铉溶液，搅拌后于4T过夜;次日4无、15000g离心10min,取沉淀以PBS(0.01molL,pH7.4)溶解,4无透析48h得到粗提的IgAo将上述粗提的IgA经SephadexG200凝胶层

13、析过滤，再过DEAE-SephadexA-52纤维素柱，得到纯化的IgA。平衡液为0.015molLTris-HCl(NaCl0.06mol-L_,pH7.4)；洗脱液为0.015mol-L-1Tris-HCl(NaCl0.3mobf1,pH7.4)O纯化的IgA通过SDS-PAGE电泳进行验证。1.2.2鸭IgG的提取采用辛酸-硫酸铉法从鸭血清中提取IgG：新鲜鸭全血经2500r-min-1离心取血清,用醋酸缓冲液稀释后加入适量辛酸，离心去沉淀，上清液用硫酸铉沉淀并悬于PBS中，透析除盐，然后纯化的IgG经SDS-PAGE电泳进行验证。1.2.3兔抗鸭IgA和IgG血清的制备按常规方法，用纯

14、化的IgAJgG分别经背部皮下接种体质量为23kg的成年健康雄性新西兰兔。免疫后每周用琼扩试验测定血清中IgA和IgG抗体效价，待效价达到132以上时心脏采血，分离血清，即为兔抗鸭IgA和兔抗鸭IgG高免血清，冻干,-20幻保存。1.3SPA-HRP间接染色法检测IgA和IgG分泌细胞石蜡切片脱蜡后放入0.8%H2O2处理30min,用含0.4%Triton-100的PBS(PH7.6)洗涤3次，每次5min；滴加5%正常山羊血清封闭30min；弃羊血清后分别滴加适当稀释比例的兔抗鸭IgA或兔抗鸭IgG高免血清,4T过夜;用含0.4%Triton-100的PBS(pH7.6)洗涤3次，每次5m

15、in；滴加适当稀释的SPA-HRP(Sigma公司)，37幻作用60min；Tris-HCl缓冲液(0.05molL,pH7.6)洗涤15min；DAB显色，晾干，中性树胶封片。对照组用PBS分别替代兔抗鸭IgA和兔抗鸭IgG。1.4组织学观察与统计用OlympusBH-2显微镜观察并拍照。利用图像分析系统测虽咽、小肠的IgA和IgG分泌细胞面积。每组选切片10张，每张切片选10个视野进行统计。15数据分析数据采用Excel2003软件初步处理后再用SPSS17.0软件进行差异显著性检验。2结果与分析2.1鸭IgA和IgG结构蛋白的验证电泳凝胶染色扫描结果显示出2条清晰的条带(图1),其中一条

16、相对分子质量为70X10,72X1O3，是鸭IgA的重链；另一条相对分子质量约为26x103,是鸭IgA的轻链。重链和轻链的分子质量与杨晓燕报道的相同，但本试验的SDS-PAGE电泳结果没有第3条带(J链)，可能是由于鸭slgA在凝胶层析的过程中J链被降解。提纯的IgG经SDS-PAGE电泳，结果显示有2条带，相对分子质量约为67x10,和26x103,分别为IgG的重链和轻链(图1)。1234MM./X105 94.4 66.245.0图1提纯的鸭IgA和IgG的SDS-PAGE电泳图Fig.1SDS-APGEeiectrophoersisofduckIgAandIgGlane1,2.IgA

17、；3,4.IgG(10|iX,5gX)；M.Marker 33.8 27.02.2鸭源禽流感灭活抗原饮水免疫对IgA分泌细胞的影响2.2.1IgA分泌细胞的形态及数IgA分泌细胞在雏鸭咽、小肠中均有分布(图2)。IgA分泌细胞为圆形或椭圆形，胞质深染成棕褐色。咽的IgA分泌细胞主要分布于黏膜固有层，并紧贴复层扁平上皮基底膜内侧，疏松结缔组织中IgA分泌细胞分布较少,腺体周围也有IgA分泌细胞分布；另外发现在咽的扁平上皮外染色呈强阳性。小肠的IgA分泌细胞主要分布在肠绒毛黏膜固有层和黏膜固有层及肠腺周围，其中肠绒毛基部数量较多。小肠的IgA分泌细胞数量要多于咽部。图2咽(a)和小肠(b)IgA分

18、泌细胞(f示分泌细胞；a.xl00,b.x200)Fig.2IgAsecretingcellsinthelaminapropriaofphnryx(a)andsmallintestine(b)(xindicatingIgAsecretingcells)2.2.2咽IgA分泌细胞面积的变化如图3-A所示，首免后第3、5和7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫锥鸭后，咽中IgA分泌细胞面积比单独用禽流感灭活抗原免疫显著或极显著增加(P<0.05,P<0.01)。在整个免疫期，单独用灭活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后,IgA分泌细胞面积与口腔滴注生理

19、盐水相比均无明显变化(P>0.05)o2.2.3小肠IgA分泌细胞面积的变化如图3-B所示，首免后第3、5和7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫雏鸭后,小肠中IgA分泌细胞面积比单独用禽流感灭活抗原免疫显著或极首免后时间/周Timeafterthefirstimmunization生理盐水Nonnalsodium;E3抗原Antigen;0葡萄糖+抗原Glucose+antigen;CpG+抗原CpG+antigen；CpG+葡萄糖+抗原CpG+glucose+antigen图3免疫后咽(A)和小肠(B)组织单位视野中IgA分泌细胞面积的变化Fig.3Changeo

20、ftheareaofIgAsecretingcellsinphnryx(A)andsmallintestineB)ofunitfieldafterimmunization显著增加(P<0.05,P<0.01)o在整个免疫期，单独用禽流感灭活抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后，小肠IgA分泌细胞面积与口腔滴注生理盐水相比差异不显著(P>0.05)。2.3鸭源禽流感灭活抗原饮水免疫对IgG分泌细胞的影响2.3.1IgA分泌细胞的形态及数量IgG分泌细胞的位置及细胞形态与IgA分泌细胞大致相同(图4)。与IgA分泌细胞数扯相比，咽和小肠中IgG分泌细胞的数量较少。图4咽(a

21、)和小肠(b)的IgG分泌细胞(t示分泌细胞；a.xlOO,b.x200)Fig.4IgGsecretingcellsinthelaminapropriaofphnryx(a)andsmallintestine(b)(findicatingIgGsecretingcells)2.3.2咽中IgG分泌细胞面积的变化如图5-A所示，首免后第3、5、7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫锥鸭后，咽中IgG分泌细胞面积均比单独用禽流感灭活抗原极显著增加(P<0.01)。在整个免疫期，单独用灭活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后,IgG分泌细胞面积与口腔滴注生理盐

22、水相比均无显著差异(P>0.05)o2.3.3小肠中IgG分泌细胞面积的变化如图5-B所示，首免后第3周，用CpG和菊萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫雏鸭后,小肠中IgG分泌细胞面积比单独用禽流感灭活抗原免疫极显著增加(P<0.01)°首免后第5周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫锥鸭后,小肠中IgG分泌细胞面积均比单独用禽流感灭活抗原免疫极显著增加(P<0.01)。首免后第7周，各组小肠中IgG分泌细胞面积相似，均无显著差异。在整个免疫期，单独用灭活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后，小肠IgG分泌细胞面积与口腔滴注生理盐水相比均无

23、显著差异(P>0.05)o15O12O9O6O3OHs=8Majors蚤jo诲,是集浇去V8-15O12O9O6O3OHs=8Majors蚤jo诲,是集浇去V8-首免后时间/周Timeafterthefirstimmunization生理盐水Normalsodium；抗原Antigen；0的萄糖+抗原Glucose+antigen；CpG+$t原CpG+antigen；0CpG+葡萄糖原CpG+glucose+antigen图5免疫后咽(A)和小肠(B)组织单位视野中IgG分泌细胞面积的变化Fig.5ChangeoftheareaofIgGsecretingcellsinphnryx(A

24、)andsmallintestine(B)ofunitfieldafterimmunization3讨论.禽流感病毒主要在鸭的肠道复制然后以较高的滴度从粪便中排出，因此增强肠道免疫力能够有效阻止病毒在肠道复制，减少排毒。而且，禽流感病毒主要通过消化道和呼吸道，尤其是消化道进入鸭体内，通过消化道免疫可直接刺激咽产生局部抗体，以阻止禽流感病毒入侵，又可增强肠道黏膜免疫力，限制病毒在肠道复制。IgA分泌细胞是局部黏膜主要的免疫活性细胞，在阻止肠道病毒粘附和入侵中起关键作用-，分泌细胞数量的变化已成为评价小肠黏膜免疫力的指标之一消化道免疫活性细胞数量的增加能增强机体对病毒的抵抗力和切断病毒的侵袭途径。

25、本试验结果表明，鸭源禽流感灭活抗原配合CpG饮水免疫后咽和小肠局部IgA和IgG分泌细胞数量均显著增加,表明免疫后消化道黏膜局部免疫力增强，这对防止禽流感病毒从咽入侵和在肠黏膜复制，减少或阻断禽流感病毒从粪便中散播将发挥有效作用。本研究还发现,IgA在咽的扁平上皮外也呈抗体阳性反应,这可能是由于IgA与黏膜上皮细胞产生的分泌片(SC)结合,通过上皮细胞的吞饮作用进入胞浆，然后释放在上皮细胞游离面或腺腔中，使黏膜表面呈阳性反应。slgA在黏膜表面形成保护层，能防御病原微生物从黏膜表面侵入。CpG是一种有效的黏膜免疫增强剂，能通过与树突状细胞相互作用,促进淋巴细胞的增殖，能够有效诱导黏膜局部和全身

26、性免疫反应i，4-,6JoCpG与抗原联合使用能诱导免疫反应。CpG不被消化酶降解，能够用于口服免疫(，J6-，71o本试验结果表明，用CpC与禽流感H9N2灭活抗原配合口服免疫引起消化道局部黏膜免疫活性细胞数量增加，消化道局部黏膜免疫力增强。高浓度葡萄糖可使紧密连接相关蛋白Zo-1表达减少，细胞间连接松懈，增加黏膜上皮细胞的通透性。本试验中添加高浓度葡萄糖意在促进禽流感灭活抗原透过上皮进入上皮下组织，从而直接剌激组织中的淋巴细胞和巨噬细胞等。从本试验结果可以看出，单独用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫鸭后，消化道黏膜局部IgA和IgG分泌细胞面积变化不大，应用CpG和葡萄糖配合禽流感灭活抗原

27、与只用CpG配合禽流感灭活抗原饮水免疫鸭效果接近，表明菊萄糖起的作用并不大,CpG有可能经过小肠上皮吸收，刺激固有层中淋巴细胞的分化和增殖。综上所述,禽流感灭活抗原与黏膜免疫增强剂CpG配合饮水免疫能有效提高鸭消化道黏膜局部的免疫应答，但能否直接切断病毒侵入机体的途径和阻止病毒在肠道粘附复制和病毒排出还需进一步验证。参考文献：IZhangX,ZhangX,YangQ.EffectofcompoundmucosalimmuneadjuvantonmucosalandsystemicimmuneresponsesinchickenorallyvaccinatedwithattenuatedNewc

28、astle-discaftevaccineJ.Vaccine,2007,25(17)；3254-326221张晓文，杨倩.禽流感火活抗原与佐剂配合鼻腔免疫对鸣呼吸道抗体分泌细胞的影响J.南京农业大学学报,2007,30(1):94-983杨倩，练高建,黄国庆，等.半胱胺对房小肠黏膜中分泌型IgA细胞和上皮内淋巴细胞的影响J.南京农业大学学报,2002,25(2)：89924HaydayA.VineyJL.Thein»andoutsofbodysurfaceimmunologyJ.Science,2000,290(5489)；97-IOO5PetersonDA,McNultyNP.Gu

29、nigeJL,etal.IgAresponsetosymbioticbacteriamamediatorofguthomeostasisJ).CellHo»t&Microbe,2007,2(5):328-339MesteckyJ,McGheeJR.ImmunoglobinA(IrA):molecularandcellularinteractionsinvolvedinIgAbiosynthesisandresponseJJ.AdvancesImmunology,1987,40:153-2456 杨宗照，华荣虹，张书等.鸭IgC提取方法的比较试就JL中国兽医科技,2001.31

30、(4):26-27杨晓燕.家鸭人工感染费瘟强毒株的动态分布、黏膜免疫及对肠道菌群的影响们.雅安：四川农业大学,20067 PerdueML,SuarezDL.StructuralfeaturesoftheavianinfluenzavimshemagglutininthatinfluenceviralcncefJ.VeterinaryMicrobiology,2000,74(1/2):77-86JOKidaH.YanagawaR,MabmukaY.DuckinfluenzalackingevidenceofdiseasesignsandimmuneresponseJ.InfeclionImmunity,198(),30(2):547-55311AgnelloD,HervGCA,LavauxA,etal.Intrarectalimmunizationwithrotavirus2/6vinw-likeparticlesinducesanantirotavirusimmuneresponselocalizedintheintestinalmucosaandprotectsagainstrotavirusinfectioninmiceJ.JournalofVirology,2006,80(8)；3823-383212YangX,QiX,ChengA,e