禽流感疫苗研究进展 (2).docx

1、禽流感疫苗研究进展白宁七孙尚芬2,姜振国21.75安市长安区杜曲街道蓄牧爵医站，陕西西安710104；2.西安市长安区动物疾病族防控制中心，陕西西安710000摘要踪述了目苛世界上的主妥禽流感疫苗，会病毒灭活疫苗、减在活疫苗、总因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA复制于疫苗、重组璃毒活栽体疫苗、反向遣传苗、具有交义保护枚的通用流感疫苗、细胞苗和件裁因植物疫苗的研究进展，为研制出工艺简单、成本低廉、保护力强的禽流感疫苗提供了参考。作者简介白宁(1980-),男，陕西长安人，助理尊成坤，从事动物疫病防拉工作,E-n»ail：bainingvetc收稿日期2012-02-11关键词禽流感病

2、毒;戎苗；研究进展中图分类号S834文献标识码A禽流感(AvianInfluenza,AI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染性疾病，可导致家禽、各种野鸟、特别是迁徙水禽的感染，被世界动物卫生组织(0IE)确立为A类传染病。1878年.Per-roncito首次报道禽流感病毒(AIV)在意大利鸡群中暴发，随后在世界各地均有AI暴发和流行的报道，给养禽业带来了巨大的经济损失自1959年以来，全世界共暴发了20多次高致病性禽流感(HPAI)。尤其是1997年发生在我国香港的禽流感感染人事件及2005年青海湖大量迁徙水鸟感染H5N1死亡事件，更加引起人们对该病的关注OA型流感

3、病毒具有典型的宿主特异性，通常感染禽类并使其致病的多为H5、H7和H9亚型，但由于流感病毒抗原经常发生变异，旦不具有交叉保护性，给禽流感的防治带来极大的困难。而目前禽流感的危害引起了世界各国的高度重视，尝试采取不同的措施来预防和控制禽流感。在众多的防控方法中，疫苗免疫占重要地位。然而由于A型流感病毒的高度变异性，各亚型的复杂性决定了目前传统疫苗的文章编号2095-3305(2012)02-062-04保护力无法达到期望效果。为此，笔者将目前世界上主要禽流感疫苗的研究进展综述如下，旨在为研制出工艺简单、成本低廉、保护力强的疫苗提供参考。1全病毒灭活疫苗全病毒灭活疫苗一般是用甲醛灭活的禽流感病毒鸡

4、胚尿饕液，辅以佐剂制成的油乳剂疫苗。该疫苗安全性好，具有良好的免疫保护作用，可制备多价疫苗，且各亚型之间不产生免疫干扰。试验证明,灭活全病毒疫苗不会出现毒力返强和变异现象，能够经受同种亚型AIV的攻击，能为鸡群提供良好的免疫保护。目前，我国H5、H7亚型禽流感灭活疫苗已研制成功，并取得了良好的免疫保护效果。但与此同时，全病毒灭活疫苗也存在一定的问题，如疫苗免疫效果是由灭活疫苗的注射剂骨和疫苗中的抗原量决定的，因此灭活苗注射的病毒量要比活疫苗高出许多倍。且制备灭活苗还必须添加佐剂，其生产还需要大量的鸡胚，成本非常高，这在禽流感大流行的情况下，鸡胚的供应将会成为疫苗生产的一个限制因素。此外，由Re

5、searchProgressofAvianInfluenzaVaccineBAI>6ngetal(AnimalHusbandryandVeterinaryStationofDuquStreetinXi'an,Xi'an.Shaanxi710014)AbstractResearchprogressofmainavianinfluenzavaccineintheworldtoday,includinginactivatedvirusvaccine,liveattenuatedvaccine,geneticengineeringsubunitvaccine,DNAvaccine

6、,RNAreplicon-basedvaccine,recombinantvirusliving-carriervaccine,reversegeneticsvaccine,crossprotectivevaccine,cellvaccineandtransgenicplantvaccinewasreviewed.Thestudyprovidesreferenceforthepreparationofa-vianinfluenzavaccinewiththeadvantagesofsimpleprocedure,lowcostandstrongprotectiveefficacy.Keywor

7、dsAvianinfluenzavirus;Vaccine;Researchprogress于接种灭活苗的机体也会产生针对病毒内部结构蛋白，如NP的特异性抗体，而这类抗体是在进行流行病学调杳时的主要判定指标，因此灭活苗的应用将导致无法区分自然感染鸡和疫苗接种鸡，从而干扰AIV疫情的也测和流行病学的调查。2减毒活疫苗减毒活疫苗是指将野毒株感染鸡胚，并在2526气下连续传代得到减毒毒株，即冷适应株，该病毒只能在25弋左右复制，不能在37%T传代，之后使用该弱毒株免疫使机体产生特异性免疫。多项人体和动物研究证实，冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都存50%7

8、0%,能够有效控制流感的流行；对群体免疫的意义更加重大，对表面抗原发生转移的流行株病毒有一定的保护作用逆。但冷适应减毒活疫苗与其他流感病毒可能发生基因重配得到毒力恢复的重配株病毒，此外，冷适应减毒活疫苗在免疫缺陷患者中使用有致病的风险。3基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗是指利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原基因导入受休菌(如大肠杆菌)或细胞，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原肽链，提取保护性肽段加入佐剂后免疫动物进而引起机体特异性免疫反应。血凝素(Hemagglutinin,HA)是构成愈流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗休

9、，为禽流感病毒中最为重要的保护性抗原。随着分子克隆技术的发展，可将HA基因连接到载体质粒上，然后导入表达系统中进行扩增和表达。试验证明，采用H5重组HA佐剂疫苗免疫的痛类在攻毒后不排毒。刘明构建了杆状病毒转移载体，分别表达了禽流感病毒H5N1的HA基因和NA基因，用这些表达产物免疫SPF鸡，结果表明，用相同亚型强毒攻击后,rBacH5免疫组、rBacNl免疫组的保护率分别为90%、50%,rBacH5和rBacNl联合免疫组的保护率为90%；HA+NA联合免疫组只需免疫1次就能取得HA单独免疫2次的效果。利用真核表达系统表达相应的禽流感病毒表面蛋白，如HA、NA和M2,表达产物纯化后作为疫苗。

10、这种亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，但不含核酸，具有很好的安全佐，也能刺激机体产生足够的免疫力。但亚单位疫苗免疫原性低、持续时间短，需要与佐剂合用，成为该疫苗发展的限制因素。4DNA疫苗DNA疫苗又琮核酸疫苗,是利用重组DNA技术将保护性抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体卜，在被直接导入到动物体内后，保护性抗原蛋白基因表达的抗原蛋白经过内源性呈给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。流感病毒是最早用于基因免疫研究的模型。与传统疫苗相比,DNA疫苗具有许多优点。首先,DNA疫苗可诱导长期或终生免疫；其次，其抗原合成和递呈过程与病原体的自然感染很相似，抗原蛋白经内源性合成后转运到绍胞表

11、面，再通过MHC-I和MHC-II类分子直接递呈给免疫系统，特别是特异性CD8+T淋巴细胞CTL的免疫反应，这些是一般疫苗不可相比拟的；再次，其可同时引起特异性体液免疫和细胞免疫应答，增强机体保护力；另外，其对不同亚型的病原体具有交叉抵抗作用，且DNA疫苗基本没有毒性逆转的可能，不存在减毒疫苗那样可能在体内毒力回升后致病的危险；同时，该疫苗易于实现联合免疫，且其免疫原性较单一，只有编码所需抗原的血凝素基因导入细胞后得以表达，而质粒载体没有免疫原性，可反复使用，无散毒和疾原毒力返强的威胁；最后，其质虽易于控制和评价，。NA序列可知，纯化工艺简便，生产迅速、成本低廉，稳定性好，便于运输和保存，不需

12、要冷藏。但DNA疫苗的研制和开发才刚刚起步.还有很多关键问题亟待解决。首先,所用载体多具有抗生素抗忤，导致被免疫的机体可能会对相应的抗生素产生抗体，给一些常见的细菌性疾病的防治带来了困难。第二，目前所研制的DNA疫苗体内免疫保护力还不是很强，这可能与DNA疫苗在机体内的生存和表达有关，很有可能是大部分质粒被机体当作异物降解，或载体在动物体内表达效率不高而降低了DNA疫苗的免疫效果。DNA疫苗正在给免疫预防治疗领域带来一场根本性的变革，但在DNA疫苗应用于人体之前，还有许多问题未完全解决，如疫苗的质量标准、制剂、效用、生产工艺和安全性等。另外,外源核酸是否会被整合到染色体中引起机体的癌变及自身免

13、疫反应等问题，还没有确切的结论，同时疫苗诱发的免疫反应强度较弱，因此，还需要大量及长期的考察。5RNA复制子疫苗RNA复制子疫苗利用源自病毒的能够自主复制的RNA,其结构蚕白基因由外源抗原基因取代，保留了非结构蛋白(RNA复制酶)基因。RNA复制酶可使RNA载体在细胞质中高水平复制，并实现外源抗原基因的高水平表达，可同时诱导细胞免疫和体液免疫应答。大量双链RNA可诱导被感染细胞凋亡，宿主细胞的凋亡有利于免疫系统识别外源抗原。RNA复制子疫苗克服了传统疫苗和普通DNA疫苗存在的缺点，具有抗原表达效率高、安全忤好、应用范围广等优点，因而被视为一种具有良好发展前景的疫苗形式。6重组病毒活载体疫苗活载

14、体疫苗是指将病原体的抗原保护性基因和基因缺失的病毒载体相连接，将制备的含有目的基因的活病毒直接免疫动物引起机体特异性免疫反应的疫苗。目前常用的病毒载体有痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等，而研究酸多的是利用痘病毒进行禽流感活载体疫苗的构建表达HA的重组病毒,该病毒可在体内复制，表达HA蛋白，从而诱导机体产生针对AIV的免疫保护力。国内进行禽流感活载体疫苗的研究集中在哈尔滨兽医研究所，2003年0拓。等构建了能同时表达H5N1亚型HA基因和NA基因的重组禽痘病毒(Fowlpoxvirus,FPV)重组疫苗，攻毒结果显示该疫苗具有良好的免疫保护性。2004年，乔传玲等将表达H5亚型禽流感病毒H

15、A和NA基因的rFPV以不同剂量分别经翅下刺珅、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于4周龄SPF鸡，结果表明，该疫苗经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射途径接种的SPF鸡，能够诱导其产生HI抗体；用100LD«的HPAIV/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)毒株攻击后，免疫鸡无发病和死亡。重组病毒所表达的外源基因在机体内随载体病毒的复制而表达，因此具有不影响疫情监测、安全性高、生产成本低等优点。然而,Swaye等研究表明，表达H5亚型禽流感病毒HA的重组鸡痘病毒对未经鸡痘免疫的肉种鸡和白来航鸡可提供很好的免疫保护作用，而先用鸡痘免疫，再用重组鸡痘病毒免疫，则会大大降低

16、免疫保护作用甚至导致免疫失败。因此，禽流感重组痘病毒疫苗应避免用于经痘病毒疫苗免疫的或自然感染野毒痘病毒的或母源抗体较高的鸡群，否则将不能诱导对禽流感的良好免疫应答。7反向遗传苗反向遗传苗是指运用反向遗传学方法从CDNA水平上获得缺失的病毒粒子，该病毒粒子感染细胞时，能在细胞内表达病毒蛋白但不能形成有感染力的病毒粒子，进而使机体产生针对流感病毒的免疫。利用该技术获得的减毒AIV,不仅能产生保护性抗体，且能诱导很强的细胞免疫，在组织培养物中生长良好，是一种很有发展前途的活疫苗。卢建红等设计带有BsmBkBsal或Aarl酶切位点的引物，用RT-PCR扩增了H9N2亚型禽流感病毒的8个基因全长片段

17、，克隆入双向转录/表达载体PHW2000,并在PB2.PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签，将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因，其他5个内部基因来自A/WSW33,进行了6种3+5组合形式的基因重排，将相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞，均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒，表明亲缘关系遥远的流感病毒可互相获取基因片段产生重蛆病毒，提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2亚型丽流感病毒在哺乳动物细胞上的宿主范围，同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作，为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒基因的结构与功能、窿流感病毒与宿主之间的关系

18、打下了基础。8具有交叉保护性的通用流感疫苗-种理想的禽流感疫苗应是无论在禽流感大流行期间，还是过渡阶段，对各种亚型的流感病毒都有效。A型流感病毒蛋白中较为保守的蛋白为NP和M,是诱导具有交叉保护性CTL反应的特定多肽，因此从理论上讲，研究交叉保护性疫苗有2条途径。Neirynck等尝试将保守M2蛋白的膜外区域(M2e)融合到B型肝炎病毒的核心蛋白上，在大肠杆菌中表达来构建一种通用疫苗，结果发现，腹腔内或肌肉注射纯化的M2HBC蛋白到小鼠体内能提供90%、100%的保护，其产生的中和抗体具有广谱性，对抗A型流感病毒感染的持续时间长等特点。但如此小的表面抗原是否能对机体对流感病毒的感染提供足够的保

19、护，还有待进一步和更大规模的验证问。Park等用田醛灭活的流感全病毒疫南经鼻腔免疫小鼠发现，该疫苗能抵御8种不同亚型流感病毒的攻击，表现出免疫效力的广谱性；研究培果还显示,交叉保护是由于NP基因刺激产生的CTL反应引起的*李永清等用研制的M2基因重组马立克氏病病毒(MDV1)免疫1日龄SPF鸡后,从第14天起免疫鸡开始产生抗体.到第21天时,83%的鸡已产生了抗体.为禽流感交叉保护型疫苗的研究提供了依据峰9细胞苗目前，市场上灭活流感疫苗是用鸡胚生产的，所以必须及时充足的供应高质it鸡胚才能保证生产。而用细胞替代鸡胚具有很大的优势，因为细胞生产的过程将更快，更易进行质堂控制和更大规模的生产。将病

20、毒在无血清甚至无蛋白的培养基培养，将明显减少微生物的感染以及对鸡胚卵清蛋白的过敏通过哺乳动物细胞培养的流感病毒制备的灭活疫苗，比鸡胚制备的能诱导更多的血清抗体，从而提供更强的保护"气目前用于制备流感疫苗的哺乳动物细胞主要是MDCK细胞和Vero细胞。10转基因植物疫苗转基因植物疫苗是借助植物遗传铸化载体将抗原基因导入植物.使其在植物中表达.生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法，是转基因植物基因工程疫苗生产技术的关键。转基因植物疫苗具有以下优势:表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；口服植物疫苗能诱导黏膜免疫反应；植物细胞的细胞壁可起到生

21、物胶囊的作用，更好地刺激机体产生特异性免疫反应；生产简便、成本低廉，不需要冷藏和低温运输;安全性好,无外源性病原污染等。宋长征等利用转基因马铃薯表达AIV的HA蛋白，结果显示，用转基因马铃薯生产口服AIV疫苗具有较好前景网。11抗独特型抗体疫苗抗独特型抗体疫苗是根据JerneNK的免疫网络学说研制的眼。一些抗独特型抗体能够和抗体的补位结合并在空间结构上模拟抗原表位，这类抗体可替代抗原作为诊断抗原检测机体的抗体水平，还可作为疫苗免疫动物，使动物产生免疫应答.，抵抗相应病原体的侵袭。李宝全等首次用纯化的鸡抗H9亚型AIV免疫球筮白(IgG)作为抗原免疫家兔，制备兔源的多克隆抗独特型抗体(Pab2)

22、,同时免疫小鼠，制备分泌抗AIV独特型单克隆抗(Mab2),试验显示，所制备的2种独特型抗体均能竞争性抑制鸡抗AIVIgG与AIV的结合，并能诱发SPF鸡产生血凝抑制抗体。该试验表明，单克隆和多克隆抗独特型抗体均能对免疫鸡产生保护作用E】。,考文献DJALEXANDER.Anoverviewoftheepidemiologyofavianinfluenza(J).Vaccine,2007,25(30):5637-5644.1 MKOBAYASHI,TTOYODA,A1SHI-HAMA.InfluenzavirusPB1proteinistheminimalandessentialsubunit

23、ofRNApolymeraseQ).ArchVirol,1996,141(3-4):525-539.(3 HBGREENBERG,PAPIEDRA.Immunizationagainstviralrespiratorydisease:areviewJ.PediatricInfectiousDiseawJournal.2004.23(11):254-261.(4 刘明.H5和H7亚型禽流感分子防制技术的研究D.北京:中国农业科学院,2000.5郸洪生，王演坤，郑世民.重组斑痘病丰栽体及其在禽流,疫苗中的应用皿黑龙江官牧善医，2006(5):22-24.(6JQIAOChuanling,YUKan

24、gzhen,JJANGYongping,etal.ProtectionofchickensagainsthighlylethalH5N1andH7N1avianinfluenzaviruseswitharecombinantfowlpoxvimsco-expressingH5haemag-giutininandN1neuraminidasegenesJJ.12新型禽流感疫苗与展望目前，新型的禽流感疫苗包括冷适应流感弱毒疫苗、基因工程活流感病毒疫苗、复制缺陷型流感病毒疫苗、RNA复制子疫苗、表位疫苗、转基因植物疫苗、沙门氏菌DNA口服疫苗等间。随着分子生物学、细胞生物学和免疫学手段的不断更新，更

25、多、更有效的疫AvianPathology,2003,32(1):25-31.7胡建和，王青，就柏林.禽流感病毒新型疫苗的研充进展J.生物技术通报，2010(8):35-39.(8|DESWAYNE,JRBECK,NKINNY.FailureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenspreimmunizedwithafowlpoxvaccineJ.AvianDiseases,2000,44(1):132-137.9卢建红，部卫星，龙进学，等.H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录/表达我体的构建和脸位/中国满毒学.2005(4):388-392.|10沈志强.禽液.感疫苗的研究进展J今日富牧善医.2009：40-41.(11)CHPARK,H