纳米铝佐剂禽流感疫苗(H5N1)对肉鸡外周血中巨噬细胞活性的影响.docx

1、纳米铝佐剂禽流感疫苗（H5N1）对肉鸡外周血中III巨噬细胞活性的影响徐爱平械，黎晓敏】，祝明I湛淋丽】，马金花之（1.西南大学动物科技学院，重庆北暗400716；2.重庆市农业学校动物科学系，重庆九龙坡401329）中图分类号：S852.5；S852.65十9.5文献标识码：B文章编号：0529-6005（2010）05-0036-03禽流感是多种家禽共患的重大动物疫病，分布广，传播快，已被国际动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。禽流感曾在世界上许多国家流行，造成的损失数不胜数。1997年我国香港地区暴发禽流感，不仅造成损失约达8000万港币，并发生H5N1亚型AIV直接感染人并引起死亡的

2、事件。此后，H5N1亚型禽流感感染人并导致死亡的事例在全球范围内流行，这引起了人们对禽流感病毒的巨大恐慌。更令人担忧的是其毒力不断增强、宿主范围不断扩大严重影响了畜禽业的健康发展及人类自身的安全。目前国内外使用的禽流感疫苗主要是灭活油佐剂疫苗K】，但禽流感灭活油佐剂疫苗首免后常常需1015d才能产生有效的免疫保护抗体，而在接种至机体产生有效保护抗体的这段时间动物没有保护性，一旦发生禽流感将造成巨大的经济损失。另外,机体对油乳苗的吸收速度慢，容易在注射部位形成肿块，这对于生长周期短的肉鸡来说，严重影响了胴体品质，因此需寻找一种高效旦能诱导机体提前产生抗体的新型疫苗佐剂。纳米技术是21世纪的前沿技

3、术，它的推出给这一问题的解决带来了曙收稿日期：2009-08-25基金项目：重庆市科委攻关课题（2006AC1014）作者简介：徐爱平（1983），女，助理讲师.硕士，从事微生物与动物防疫等研究，E-mail:tracy520927通讯作者:黎晓敏，E-mail：lixiaomin662光。1981年Kreuter等首次将纳米材料应用于疫苗佐剂，发现纳米材料用作疫苗佐剂，包裹或表面结合抗原的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露,同时使抗原结构更稳定，且能促进淋巴集结的摄取，在体内能引起强烈的特异的免疫反应在国内，汤承，吕风林等将纳米氢氧化铝佐剂用于兽医疫苗也发现，纳米材料是一种很好的新型免疫佐剂

4、仍句。本课题组采用纳米A1（OH）3,通过物理吸附与油乳剂禽流感疫苗中抗原含量相同的禽流感H5抗原（AIVH5）,制作AI纳米氢氧化铝佐剂疫苗，以肉鸡为试验对象，研究其对肉鸡的免疫效果。本文就肉鸡注射疫苗后巨噬细胞活性进行了检测和分析。1材料与方法1.1主要材料及仪器A1（OH）3纳米颗粒由本课题组研制，经重庆科美药友纳米生物技术开发有限公司使用激光粒度仪检测平均粒径为197.2nm,颗粒近球形，分布均匀；常规A1（OH）3佐剂由武汉生物制品研究所提供，平均粒径为1398.4nm；禽流感H5N1亚型油佐剂商品疫苗由广东永顺生物制药有限公司生产（批号：2008072）；纳米铝和常规铝佐剂禽流感H

5、5N1灭活疫苗由本课研究组制作，制苗用灭活病毒尿囊液由广东永顺生物制药有限公司提供（批号：2008072）,其尿囊液批次、抗原效价及同体积免疫量中的病毒含量与所选对照商品苗相同；综上所述，SLT-Ue能刺激微血管内皮细胞对IL-8和IL6的分泌增加，刺激相应炎性细胞增殖,促进释放炎性物质，加重炎症反应，改变微血管通透性，进而形成水肿，这可能是SLT-fle的致病机理之一；PGL的分泌增加，其维持微血管正常舒缩的功能失调，导致血管通透性发生改变,进而引起水肿，这可能是SLT-Ue的另一致病机制。参考文献：，KauscheFM,DeanEA,ArpLI,etal.Anexperimentalmod

6、elforsubclinicaledemadiseaseEscherichiacolientertoxemia）manifestasvascularnecrosisinpicsfJ.AmJVetRes.1992,53(3):281-287.1 Waddell1'E,CoomberBL,GylesCL.Localizationofpotentialbindingsitesfortheedemadiseaseverotoxin(VT2e)inpigsfjj.CanadianJournalofVeterinaryResearch,1998,62(2) ：81-86.2 索占伟，穆祥，许剑琴，

7、等.犬鼠肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养J.解剖学报，2005,36(2):214-217.3 邹敏君，刘肖布.李毅,等.IL-8诱导血管内皮细胞迁移的实验研究.生物医学工程学杂志,2006；23(5)：1013-1016.4 KochAE»PolveriniPJ,KunkelSL,etal.Interleukin-8asamacrophage-derivedmediatorofangiogenesisJScience,1992,258(5089)；1798-1801.5 朱金水，朱励，余小虎，等.氧化苦参碱对肝纤维患者IL-6JL-8JL10水平影响JI中国免疫学杂志，2003,19

8、(3):191-192.印度墨汁，购于北京市西中化工厂，批号050301;LSZ试剂盒，购于南京建成生物工程研究所（批号20081013）。1.2 试验动物分组及处理1日龄健康雏鸡240只，购于荣昌广顺。按常规方法免疫及饲养。14日龄时，将试验动物随机分为4组，即油乳剂疫苗组（OE）、纳米疫苗组（NAHA）,常规无机铝组（AHA）,对照组（C）。每组随机抽取10只抽血测母源抗体。随后油苗组左侧胸肌注射油乳苗0.5mL/只，纳米疫苗组左侧胸肌注射纳米佐剂苗0.5mL/只，常规无机铝组左侧胸肌注射常规铝疫苗0.5mL/只，对照组左侧胸肌注射灭菌生理盐水0.5mL/只。1.3方法3.1巨噬细胞吞噬功

9、能的测定（碳廓清试验）被试4组鸡，每组随机取5只，分别在21日龄、35日龄、49日龄时，每千克体重翅内静脉注入1：3稀释的印度墨汁。.2mL,并立即计时，注入墨汁后2min、10min分别从心脏采血20L,加到2mL的0.1%Na2CO3溶液中摇匀，用721分光光度计于600nm波长处比色，测定光密度OD值（分别用OD2和OD。表示2min和10min时所取血样的光密度），用0.1%Na2CO3溶液做空白对照。然后将鸡处死，取肝脏和脾脏称重，计算吞噬指数。吞噬指数a=（体重/肝脏重+脾脏重）XKl/3说明：a为吞噬指数；K为碳廓清率，K=lg（ODJ-lgCOD2）/T2-T19OD】、OD2

10、分别为2、10min时取血制得的待测液的透光率；T】、T2为注射印度墨汁后的采血时间。1.3.2 血清溶菌酶（LSZ）含量的测定在21日龄、35日龄、49日龄时每组随机取5只，采血0.5mL分离血清，将血清与应用菌液反应,测定透光度，计算溶菌前含量，公式为：溶菌酶含量（jug/mg）=测定管透光度一空白管透光度）/（标准管透光度一空白管透光度）。具体方法见试剂盒。1.4数据分析与处理所有数据均以平均值土标准误表示。采用SPSS13.0统计软件进行方差分析。2结果与分析1巨噬细胞吞噬指数的测定见表lo表1巨噬细胞吞噬指数注：表内数字为X土SE,同列上标小写字母不相同者差异显著（P<0.05

11、）；相同者或无字母标记者为差异不显著（P>0.05）,下表同日龄/组别21d35d49d纳米组7.89土0.32b8.86±0.1610.39±0.52油苗组6.32±0.9.04±0.2411.55±0.56常规铝组6.67±0.45ab8.83±0.3810.81±0.43对照组6.32±0.878.33±0.2310.28±0.24由表1可知：21日龄时，纳米蛆巨噬细胞的吞噬指数明显高于其他三组，且与油苗组和对照组差异显著（PV0.05）；35日龄时，油苗组巨噬细胞的吞噬指

12、数最高，纳米组次之，各组差异均不显著（P>0.05）；49日龄时，油苗组巨噬细胞的吞噬指数依然最高，常规铝组次之，对照组最低，纳米组与其他组差异依然不显著（P>0.05）o2.2血清LSZ含量的测定见表2。表2血清溶菌酶含量日龄/组别21d35d49d纳米组41.17土1.4砂51.86±2.1260.72±1.70油苗组36.03±2.4P53.92±3.7062.46土L91常规铝组39.76±0.81ab48.67±3.5860.67±2.47对照组36.55±1.60a47.22±4.

13、4759.26±1.33由表2可知：21日龄时，纳米组溶菌酶的含量最高，与油苗组、对照组差异显著（PV0.05）,与常规铝组差异不显著（F>0.05）；35日龄时，从溶菌酶含量数值来看，油乳剂组纳米组>常规铝组>对照组，其他组与纳米组差异不显著（P>0.05）；49日龄时，油苗组溶菌酶的含量仍然最高，其他组与纳米组差异依然不显著（P>0.05）。3讨论1本试验分别在21日龄、35日龄、42日龄测定了肉鸡巨噬细胞吞噬指数以及血清中溶菌酶的含量，发现21日龄时纳米组巨噬细胞的吞噬指数以及血清溶菌酶的含量均明显高于其他三组，与油苗组和对照组差异显著（P<

14、0.05）,其他各组之间差异不显著（P0.05）,两项试验结果基本相同，均表明纳米疫苗在肉仔鸡生长的早期阶段具有促进巨噬细胞活性的作用。丁小波等报道，将氧化锌纳米化，以硫酸锌为对照，研究其对AA肉鸡血液溶菌酶含量的影响，结果显示，纳米氧化锌能极显著提高血液中溶菌酶的含量（F<0.01）且其含量约为硫酸锌的2倍，表明纳米氧化锌能提高机体的非特异性免疫功能李艳芬等研究纳米二氧化钛经器官染毒对大鼠肺巨噬细胞免疫功能的影响，结果显示，不同粒径的纳米二氧化钛的暴露均可增强大鼠PAM的吞噬功能，大鼠PAM的NO合成释放量高于对照组（PV0.05）幻。何萍等用纳米铝佐剂吸附HBsAg,研究其免疫学效应

15、时也观察到与阴性对照组比较,两组铝佐剂对小鼠腹腔巨噬细胞非特异吞噬能力均显著提高（P<0.05）。采用皮下一次免疫程序，纳米铝佐剂组的。1）62。值略高于常规铝佐剂组，结果表明，纳米铝佐剂对提高小鼠腹腔巨噬细胞的非特异吞噬能力强于常规铝佐剂（虽然二者无显著性差异）。本试验结果与上述报道基本一致，纳米铝佐剂辅佐的禽流感疫苗能提高外周血中巨噬细胞的活性，对非特异性免疫有一定的增强作用。外源激素PMSGHCG对休情期毋拶卵篥组农的影响刘平，吕占军，李明辉，黄伟平(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030)中图分类号：S859.79+3；S857.2*2文献标识码：B文章编号：0529

16、-6005(2010)05-0038-01貉是珍贵的毛皮动物，也是我国生产的主要毛皮动物之一，由于貉属季节性一次发情动物，如果当年不能配种，则影响母貉的利用率。对此万国有等曾采用绒毛膜促性腺激素(HCG)使两年均未发情收稿日期：2009-0416基金项目：东北农业大学科学研究基金作者简介：刘平(1984)，女，硕士,从事临床兽医产科方面的研究9E-mail:liuping20060807通讯作者：吕占军，E-mail：lzhj_2004YAYAY>«AAYAYAVAY,AyAAYAY3.2巨噬细胞主要参与动物机体的非特异性免疫反应，可以通过吞噬作用杀伤病原微生物和肿瘤细胞，还可

17、释放一些细胞因子和效应分子来发挥多种生物学作用，是机体产生特异性免疫应答的基础和机体维持内环境稳定的重要因素。大多数抗原经巨噬细胞处理后，免疫原性会大大增强，从而刺激机体产生良好的免疫应答，因此，测定机体巨噬细胞的功能，对了解机体的非特异性免疫功能具有非常重要的意义。目前评价巨噬细胞吞噬能力的指标有以下两个.用碳廓清试验测定吞噬细胞的吞噬指数，以反映机体内单核-巨噬细胞的吞噬活性，巨噬细胞的吞噬能力与其激活程度有关；2.通过测定血清中溶菌酶含量来评价机体吞噬系统功能。据文献报道，巨噬细胞的碳粒廓清指数反映了单核乔噬细胞系统的吞噬功能苻口。颗粒异物经静脉注射进人血循环后，迅速为单核吞噬细胞所消除

18、，其中主要被定居在肝和脾脏的巨噬细胞所吞噬。胡福良也报道，若将异物量固定，则自血液中消除的速率可以反映单核吞噬细胞的吞噬功能:戚。血清溶菌酶是由巨噬细胞合成并能迅速释放到细胞外的一种重要水解前。当血清溶菌酶活力增加时，吞噬细胞活性增加，将导致吞噬细胞产生大量活性物质，这些活性分子对肿瘤细胞、病原体细胞都有强大的杀伤作用，并将进一步调节机体免疫细胞的功能，介导体液免疫和细胞免疫，促进机体的免疫保护机制高水平的溶菌酶含量表明吞噬细胞处于儿乎活化状态以及抗原递呈作用的增强，从而增强机体的抗菌防御机能。3.3纳米粒子一般是指粒径在1100nm范围内的超微粒子3】，它具有独特的生物学性质和载体结构特性。

19、将氢氧化铝佐剂制备成纳米颗粒，具有表面反应活性高、表面活性中心多、吸附能力强等这些及发情不正常的母貉均发情配种李志状等用孕马血清促性腺激素(PMSG)使繁殖率差空怀率高的母貉均交配，受胎率83.3%。但这有关母貉生殖的研究多在繁殖季节进行，而本试验则在母貉非繁殖季节(12月初)对初产貉肌肉注射不同剂量的PMSG和HCG,以其诱导发情，诱发卵泡发育，为今后母貉人工繁殖技术的普及、人工同期发情和配种、保存优良品种而进行的胚胎移植技术的研究等提供理论基础。<AyAA»<一A优异性质.从而可能吸附更多的抗原，包裹或表面结合抗原的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时使抗原结构更稳定，且能促进淋巴集结的摄取，在体内能引起强烈的特异的免疫反应，而且纳米材料所运载或包裹的抗原正是巨噬细胞和树突状细胞的首选吞噬目标，为实现有效的抗原提呈完成了重要一步，也为机体的免疫应答奠定了坚实的物质基础。参考文献：I 金宁一.高致病性禽流感的流行及其预防控制J.中国免疫学杂志.2006,22(1):5-12.2_ShaneS.Avianinfluenza.ControlandpreventJPoultryInternational.1998,37(4)：312-315.3