高效液相色谱法测定保健食品中维生素E的测量不确定度评定

1、 高效液相色谱法测定保健食品中维生素E的测量不确定度评定 高效液相色谱法测定保健食品中维生素E的测量不确定度评定林贤邦，陈宏壁，陈彩云，苏昭仑，蔡伟江*（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040） 摘 要：利用高效液相色谱测定保健食品中维生素E的含量,分析了不确定度来源,建立了高效液相色谱含量测定法的数学模型。对其中的标准溶液配置、样品准备、测量重复性等各个不确定度分量进行评估。计算得出本实验测定结果的扩展不确定度为U=1.14%。关键词：不确定度；高效液相；维生素E；保健食品High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Was

2、 Developed For The Determination Of Vitamin E In health Food Measurement Uncertainty EvaluationLin Xianbang，Chen Hongbi，Chen Caiyun，Su Zhaolun；Cai Weijiang(By-Health Co.，Ltd,Guangdong Zhuhai 519040)Abstract: Using high performance liquid chromatography (HPLC) determination of the content of vitamin

3、E in health food, analyzes the sources of uncertainty, established the mathematical model of high performance liquid chromatography (HPLC) content measurement. About the configuration of standard solution, sample preparation, to evaluate the uncertainty components of measurement repeatability. Calcu

4、lated from the experiment, the expanded uncertainty of determination results for U = 1.14%.Key words: uncertainty； high performance liquid；vitamin E； health food 维生素E是指具有生育酚生物活性的一类物质，在自然界中共有8种存在形式：-T，-T，-T，-T四种生育酚， -TT，-TT，-TT，-TT四种生育三烯酚。维生素E（Vitamin E）是一类脂溶性维生素，易溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中。本中心测定保健品中维生素E依据GB 5413

5、.9-20101中维生素E含量的测定方法进行测定。依据检测实验室具有并应用测量不确定度的程序对检测结果的测量不确定度进行评定，并依照JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示2要求，建立维生素E含量的不确定度评定的一般模式，根据评定结果确认方法制定的可行性范围的一般方法。1 测定方法描述1.1 测量方法GB 5413.9-20101.2 方法提要试样皂化后，经石油醚萃取，蒸走石油醚并无水乙醇定量溶解，以甲醇为流动相，使用填料为C18,4.6mm×250mm,5m的不锈钢柱和紫外可变波长检测器UV294nm，流速1.0min/mL,柱温40°C，对样品的维生素E进行

6、液相色谱分离和测定。1.3 维生素E含量（mg/g）计算公式 X=C*V/M式中： X样品维生素E的含量； mg/gM样品的质量，g；V样品的稀释倍数，mL；C样品溶液中维生素E的浓度，mg/mL。1.4分析步骤1.4.1标样溶液的配制 精确称取38.33mg维生素E标准品于50ml容量瓶中，加入乙醇溶解后定容至刻度。 维生素E校正：精密量取生育酚1mL，用无水乙醇定容至25mL，以乙醇为空白，在294nm波长处测定d-生育酚吸光度，按校正公式:C=A*V*10/E。其中C是维生素E浓度（单位为mg/mL），A是紫外吸光度，E是维生素E1%比色光系数，V是标准液稀释倍数；10单位转换系数。(d

7、-生育酚吸光系数为71)。1.4.2样品处理1.4.2.1皂化精确称取样品适量于250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 4550水使其溶解，加入约100mL 1.5%抗坏血酸的乙醇溶液，充分混匀后加入25mL氢氧化钾溶液混匀，放入磁力搅拌子，充氮排出空气，塞上瓶塞。将锥形瓶放入恒温磁力搅拌水浴锅中，控制水温在53±2，皂化45min后，取出立刻冷却至室温。1.4.2.2 提取及浓缩用少量水将皂化液全部转入500mL分液漏斗中，加入100mL 石油醚，轻轻摇荡，排气后塞好瓶塞，室温下振荡约10min后静置分层，将水相转入另一500mL 分液漏斗中，按上述方法进行二次萃取。合并醚液，用水洗

8、至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，醚液收入250mL 圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40±2充氮条件下蒸至近干，残渣紧密加入25mL乙醇，超声溶解，过膜后待测。1.4.3测定待仪器稳定后,注入标准溶液和试样，根据标准溶液和试样的峰面积，算出试样中的含量。1.5 主要仪器电子天平AL204（METTLER TOLEDO）；高效液相色谱仪1260（Agilent technologies）；紫外分光光度计UV-2450（岛津）。2 分析过程2.1 识别不确定度来源A类标准不确定度：通过实验测得数据，以统计分析方法评定的不确定度，结果以实验标准差表征；B类标准不确定度：根据经验、资料及假

9、设的不确定度以概率分布估计获得的标准偏差表征。2.2 不确定度的来源（1）试样重复测定时，总重复性引起的不确定度ur(x1)。（2）标准物质引起的标准不确定度ur(x2)。（3）样品引起的标准不确定度ur(x3)。（4）仪器（液相色谱仪）引起的标准不确定度ur(x4)。根据以上分析，不确定度来源如图的因果图所示。重复性样品吸光度测量稀释d-生育酚的含量 w液相色谱仪人员操作样品称量标准物质称量皂化仪器定容浓缩图1 维生素E试样有效成分含量测定的不确定度来源2.3 不确定度来源量化2.3.1不确定度传播律由于数学模型是非线性模型，采用相对不确定度合成公式：ucr(x)= u2r(x1)+ u2r

10、(x2)+ u2r(x3)+ u2r(x4)1/22.3.2标准不确定度各分量的评定2.3.2.1试样重复测定时，总重复性引起的标准不确定度分量ur(x1)u(x1)包括：人员、环境、仪器重复性等因素引起的不确定度；标准物质；天平重复称量引起的不确定度等。本法按“GB 5413.9-2010 维生素E”的要求，通过对同一试样进行实验室内部比对试验，得出一组数据，见表1。表1 样品中维生素E含量重复测定10次结果序 号含量（%）14.54824.55334.55344.54854.5464.54774.55184.55194.552104.549维生素E含量测量单次的标准偏差为：S1=0.003

11、88158标准不确定度: u(x3.2.1)= =0.00388158/=0.001228相对标准不确定度为：= =0.001228/4.5492=0.02699%此数值可作为测量重复性的方法确认结果，以后评定可采用此数据。ur(rep)=ur(x2.3.2.1)= 0.02699%在实际工作过程中，当测定某维生素E样品中维生素E含量2次时，取其算术平均值4.549作为测量结果，故测定重复性引起的标准不确定度分量为：ur(x1)=ur(x2.3.2.1)/=0.02699%/=0.02%2.3.2.2标准物质引起的标准不确定度分量ur(x2)2.3.2.2.1标准物质校正前稀释引入的不确定度u

12、r（x2.3.2.2.1）溶液定容过程引起不确定度主要由1mL 单标移液管（B级）引入的不确定度。2.3.2.2.1.1 1mL单标移液管校准产生的标准不确定度 ur（x2.3.2.2.1.1）按照1mL单标移液管的校准证书知，实验中所用的1mL单标移液管都属于B级测量结果的扩展不确定度U=0.00048mL， k=2，属于正态分布，则有： 标准不确定度为：u(x2.3.2.2.1.1)=0.00048/2=0.00024mL相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.2.1.1)=0.00024/1=0.024%2.3.2.2.1.2溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度ur（x2.3.2.2

13、.1.2）假设溶液与校准温度的差异为±5，移液管的体积为1mL，水体积膨胀系数水为(2.1×10-4)/，水的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此只需考虑水的体积膨胀即可，按矩形分布，取k，则有：标准不确定度为：u（x2.3.2.2.1.2）=1×5×2.1×10-4/0.00061mL 相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.2.1.2)= 0.00061/1=0.061%1mL单标线移液管产生的合成相对标准不确定度：ur(x2.3.2.2.1)=0.07%2.3.2.2.2溶液定容过程引起的不确定度ur（x2.3.2.2.2） 溶液定容过程

14、引起不确定度主要由25 mL单标线容量瓶 (B级) 引入的不确定度。2.3.2.2.2.1 25 mL容量瓶校准产生的标准不确定度 ur（x2.3.2.2.2.1）按照25 mL单标线容量瓶的校准证书知，实验中所用的25 mL单标线容量瓶都属于B级测量结果的扩展不确定度U=0.01mL， k2，属于正态分布，则有：标准不确定度为：u(x2.3.2.2.2.1)=0.01/20.005mL相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.2.2.1)=0.005/25=0.020%2.3.2.2.2.2溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度ur（x2.3.2.2.2.2）假设溶液与校准温度的差异为

15、77;5，容量瓶的体积为25mL，水体积膨胀系数水为(2.1×10-4)/，水的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此只需考虑水的体积膨胀即可，按矩形分布，取k，则有：标准不确定度为：u（x2.3.2.2.2.2）=25×5×2.1×10-4/0.016mL 相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.2.2.2)=0.015/25=0.064%25 mL单标线容量瓶产生的合成相对标准不确定度：ur(x2.3.2.2.2)=0.07%2.3.2.2.3标准物质浓度校正引入的不确定度ur（x2.3.2.2.3）用紫外分光光度计进行浓度校正，维生素E标准物质吸光度

16、=0.2177；紫外分光光度计的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.0022，k=2，属正态分布，则有：标准不确定度为：u(x2.3.2.2.3)=0.0022/2=0.0011相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.2.3)=0.0011/0.2177=0.506%由上面分析可得，维生素E标准物质引起的相对标准不确定度为：= =0.52%2.3.2.3维生素E样品引起的标准不确定度ur(x3)2.3.2.3.1样品称量引起的不确定度ur（x2.3.2.3.1）用电子天平进行称量，维生素E试样重量m=0.2243g, 天平的校准证书给出的测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.3

17、mg，k=2，属正态分布，则有：标准不确定度为：u(x2.3.2.2.2)=0.3/2=0.00015g相对标准不确定度为：ur(x2.3.2.3.1)= 0.00015/0.2243=0.067%2.3.2.3.2 样品处理引起的不确定度ur（x2.3.2.3.2）将样品处理引起的不确定度量化，用回收率来整体评价样品处理过程的不确定度。分析程序的回收率在实验室确认使用标准加入法分析。表2收集了实验室对含维生素E样品中的维生素E标准回收率进行10次分析的结果。表2 维生素E标准回收率分析结果测量组分加入标准的量/mg测量次数nRec平均回收率/%S2标准偏差/%维生素E1.5331098.76

18、0.6由上面分析可得，维生素E样品引起的相对标准不确定度为：= =0.20%2.3.2.4液相色谱仪引起的不确定度ur(x4)检测结果的重现性主要受操作人员的样品处理过程的一致性，样品的均匀性和仪器本身的性能因素的影响，该不确定度属A类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估，其中的测量结果如下表3：表3重复进样5次峰面积的测量值序号峰面积A14355.4277324374.0297934353.9477544362.0668954359.55566平均值4361.00556单次测量结果的标准偏差：标准不确定度为： u(x2.3.2.4)=7.125/=3.187相对标准不确定度为：=3.187

19、/4361.00556=0.08%表4相对标准不确定度一览表名称不确定度来源类型相对标准不确定度值ur (x1)方法总重复性A0.02%ur (x2)维生素E标准物质B0.52%ur (x3)维生素E样品A0.20%ur (x4)液相色谱仪A0.08%2.4合成标准不确定度评定由表3中各相对不确定度合成ucr(x)=u2r(x1)+u2r(x2) + u2r(x3) + u2r(x4)1/2 =(0.02%)2+(0.52%)2+(0.20%)2+(0.08%)21/2=0.564%3 扩展不确定度评定扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信概率p=95%,则k=2，因此维生素E样品中的维生素E含量测定的相对扩展不确定度为： U=k×ucr(x)=2×0.57%=1.14%4 测量不确定度的报告与表示维生