微生物限度-直接接种方法以及菌落计数

1、菌落总数百科名片菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等） 每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37C培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要 求的以及非嗜中温的细菌， 由于现有条件不能满足其生理需求， 故难以繁殖生长。 因此菌落 总数并不表示实际中的所有细菌总数， 菌落总数并不能区分其中细菌的种类， 所以有时被称 为杂菌数，需氧菌数等。目录菌落总数介绍 检验方法说明（一）样品的处理和稀释：（二）倾注培养（三）计数和报告菌落总数介绍菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的

2、能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每 个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量， 它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求， 以 便对被检样品做出适当的卫生学评价。 菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的 优劣。检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的 10 倍递增稀释液，然后从每个稀释 液中分别取出 1mL 置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间 后（一般为 48 小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，

3、依据稀释倍数，计算出每克（或每 ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释倾注平皿培养 48小时计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、 稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进， 对吸管内液体的流速， 稀释液的振荡幅度、 时间和次数以及放置时间等 均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定SN0168-92 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数 说明（一）样品的处理和稀释：1.操作方法：以无菌操作取检样2

4、5g （或25ml），放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1： 10 的 均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后， 最好置灭菌均质器中 以800010000r/min的速度处理1min，制成1: 10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1: 10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试 管混合均匀，制成 1： 100 的稀释液。另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。2.无菌操作：操作中必须有“无菌操作” 的

5、概念， 所用玻璃器皿必须是完全灭菌的， 不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用 75% 乙醇在包装开口 处擦拭后取样。 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工 作台暴露 15分钟，每个平板不得超过 15 个菌落。 3采样的代表性：如系固体样品， 取样时不应集中一点， 宜多采几个部位。 固体样品必须经过均质或研磨， 液体样品须经过振 摇，以获得均匀稀释液。4样品稀释误差： 为减少样品稀释误差， 在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。 在进行连续稀 释时， 应将吸管内液体沿管壁流入， 勿

6、使吸管尖端伸入稀释液内， 以免吸管外部粘附的检液 溶于其内。 为减少稀释误差， SN 标准采用取 10mL 稀释液，注入 90mL 缓冲液中。 5稀释液： 样品稀释液主要是灭菌生理盐水， 有的采用磷酸盐缓冲液（或 0.1蛋白胨水） ， 后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。 如对含盐量较高的食品 （如酱油） 进行 稀释，可以采用灭菌蒸馏水。（二）倾注培养1操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择23 个适宜稀释度，分别在制10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度 做两个平皿。将凉至46C营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，

7、混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有 1ml 稀释液（不含样品） 的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36 ± 1C温箱内培养48 ± 2h,取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2 倾注用培养基应在 46 C水浴内保温， 温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应 以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一， 从 1220ml 不等，一般以 15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底 部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3 为使菌落能在

8、平板上均匀分布，检液加入平皿后， 应尽快倾注培养基并旋转混匀， 可正反两个方向旋转， 检样从开始稀释到倾注最 后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。4 培养温度一般为37C（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30C）。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度， 琼脂平板培养48h 后，培养基失重不应超过15%。5 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4 C环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清

9、，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC）,培养后菌落呈红色，易于分别。注意事项：（ 1 ）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。（ 2）吸液体时液体不能进入吸头。（ 3）样品稀释时一定要混匀。（4）倒培养基前， 瓶口要过火焰。（ 5）一定要有空白对照。（ 6）培养基温度控制，培养基薄厚。（ 7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。（三）计数和报告1 操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放 大镜检查， 以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计 算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。2到达规定培养时间，应立即计数。

10、如果不能立即计数，应将平板放置于0 4 C,但不得超过24h。3.计数时应选取菌落数在 30300 之间的平板（ SN 标准要求为 25250 个菌落），若有二个稀释度均 在 30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2 取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之。如均小于 30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于 300，有的又小于 30 ，但均不在 30300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数

11、乘以稀释倍 数报告之。 如所有稀释度均无菌落生长， 则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。 有的规定 对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。 如出现逆反现象， 则应视为检验中的差错 （有的食品有时可能出现逆 反现象，如酸性饮料等） ，不应作为检样计数报告的依据。6当平板上有链状菌落生长时， 如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限， 则应作为一个菌落计， 如存在有几条不同 来源的链， 则每条链均应按一个菌落计算， 不要把链上生长的每一个菌落分开计数。 如有片 状菌落生长，该平板一般不宜采用， 如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀， 则可 以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。 7当计数平板内的菌落数过多 （即所 有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍 数作为该平板的菌落数。8菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100 时，按实有数字报