研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展

1、争辩蛋白质分散凝胶的技术进展摘要由于蛋白质形成的凝胶会影响食品的质构和品质,所以争辩蛋白质凝胶对于食品科学有极其重要的意义。然而,蛋白质形成凝胶的机理过于简单,需要更先进的技术来争辩。介绍了用于蛋白质凝胶争辩的最新技术进展,如原子力显微镜(AFM),共聚焦激光显微镜(CSLM)和漫射波光谱(DWS)。与传统争辩凝胶的方法如动态流变仪和扫描电子显微镜(SEM)相比,这些新方法简化了样品的预处理,有实现在线测定的可能。由于样品处于自然状态,所以反映的信息更具有真实性,加上高辨别率,可以实现蛋白形成凝胶过程分子水平的可视化。因此,接受以上的新技术可以为争辩蛋白凝胶的形成供应更多的信息。分散和凝胶过程

2、对食品加工起着重要的作用,它们能形成食品所需要的质构,也会带来不需要的沉淀或是分层现象。因此,争辩胶体形成的特性对于稳定和形成食品所需结构格外重要,并且通过把握凝胶反应优化食品加工过程,提高食品品质。对于食品体系的凝胶和分散已经有了深化的争辩,但分散凝胶现象还鲜有报道。由于争辩凝胶过程有以下困难:首先,蛋白和多糖是大分子,三维结构描述和定量困难。其次,凝胶过程是一个简单的反应体系1。例如,球蛋白的凝胶过程,通常分为蛋白分子开放,解聚和聚合,分散2的步骤。在热变性的过程中,自然蛋白分子伸展,暴露出功能性基团(如巯基和疏水基团)。随后,为了降低体系的能量,蛋白通过形成二硫键或疏水相互作用发生分散3

3、-4。当蛋白浓度高于形成凝胶的临界点时,分散连续进展形成凝胶结构。在整个反应过程中,最终的凝胶和分散体的结构受环境因素影响(蛋白浓度、pH、离子强度、温度等)很大。食品是个简单的体系,一些成分会影响蛋白分散凝胶的过程如蛋白蛋白的相互作用,通过转变二硫键形成、疏水相互作用、氢键或是范德华力,转变形成凝胶体的凝胶特性5。此外,接受传统的分析手段难以获得更加深化真实的凝胶形成信息。尽管接受动态流变仪、显微镜和动态光散射技术可以分析凝胶形成过程,但是这些方法主要通过分析分散发生过程时粒子尺寸或是弹性模量G的变化来进行争辩6-9,通常需要简单繁琐的样品前处理过程,如稀释、机械变形、干燥、冻干等,这些处理

4、睬破坏易裂开的弱凝胶,影响亚稳定体系。因此,保持体系接近原始自然状态对于考察物理化学因素对于凝胶最终质构的影响格外重要。抱负的分析方法应当是非破坏性的、非干扰性的技术,可以让样品处于自然状态下测定,从而获得处于软凝胶状态下,凝胶相互作用的信息10。伴随科技的进展,一些新的非破坏性的技术应用于蛋白质凝胶和分散的争辩中。文章论述了原子力显微镜(AFM),激光共聚焦显微镜(CSLM)和散射光波谱(DWS)用于食品蛋白质分散凝胶的争辩。在我国,虽然原子力显微镜已经广泛用于多糖结构的争辩11-13,但是用于蛋白质凝胶和分散的争辩报道还很少。1AFM用于蛋白质分散凝胶AFM起源于隧道扫描显微镜技术,它广泛

5、应用于生物、物质结构、分子生物学等领域。AFM用于食品科学中以下六个方面14:AFM可以定性描述食品大分子的结构;通过AFM成像供应的结构参数描述食品加工和储存过程中定量分析分子结构变化;显示不同分子之间的相互作用;为操控食品大分子供应条件;描述食品表面因物理特性变化而带来的微小变化;加工纳米食品的工具。1. 1AFM的原理AFM的成像是通过“感觉”而非“观看”样品。在AFM观测样品时,一个安装在悬臂上的尖端扫描样品表面,通过记录悬臂的偏斜,通过激光二极管发出的激光照射在悬臂的末端,经过镜面反射把激光放射到光电二极管检测器上,得到悬臂偏斜的信号。当扫描样品时,样品表面的拓扑结构通过尖端和样品力

6、的变化使悬臂发生偏斜。通过电脑处理悬臂偏斜变化形成样品表面三维结构15。AFM的观测模式有三种:接触、非接触和小扣。在接触模式中,尖端始终与样品表面接触,而非接触模式中,悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。小扣模式中,尖端与样品间歇接触,通常每秒接触300 000次,削减接触模式中产生的剪切力对于样品的破坏,这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品。1. 2AFM的特点与传统的电子和一般光学显微镜相比,AFM具有以下优点14, 16。具有高辨别率和大的放大倍数。AFM没有透镜,因此不受衍射极限或者球面像差的限制,对于某些样品可以实现原子级别的辨别率。简化样品处理的过程。

7、AFM是非破坏的分析方法,不需要染色或是覆膜处理,也不用高能量的粒子流,不需要导电衬底,不受样品稠度的影响,观测时样品可以处于溶液中,基本达到在自然状态下或是近似自然状态下观测样品。可同时得到样品的二维和三维成像。可以连续的观测样品变化,所以可以直接观测正在进行的反应过程。如酶反应的过程。为操控大分子和调查大分子之间的相互作用供应了可能。然而,目前AFM也有以下缺点:相对较小的扫描面积,较慢的扫描速度,对于过于软的样品成像困难等1. 3AFM在蛋白分散和凝胶上的应用AFM能有效地供应凝胶结构信息,进而补充流变仪或化学分析蛋白分散结构信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白热分散现象,争辩发觉乳清蛋白

8、分散体显示了同-乳球蛋白分散体相像的微观结构17。在pH 7时,无论NaCl浓度如何变化,乳清蛋白分散体主要由椭球形微粒构成。以上争辩结果对于理解不同条件下得到的热导致乳清蛋白凝胶特性差异供应了基础。接受小扣模式AFM观看到加热后-乳球蛋白,发觉它形成一种有规律的纤维结构,长度约25nm,厚度是1或2个蛋白单体14。这证明在低pH低离子强度下,形成的热导致-乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反应。Iwasaki等14接受AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响,发觉在70时原来的串珠结构变成绳子结构,但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。Yang等18使用AFM观看鲶鱼凝胶结构,发觉鲶鱼凝胶中具有平

9、均直径为118 nm的环形孔洞球形分散体的平均直径为267 nm。他们认为球状分散体和环形孔洞的形成与水和离子渗透过正在水解胶原质时的方式有关。AFM能从分子水平上解释食品流变学特性的差异,从力学的角度揭示蛋白分散特性。Iwasaki等19报道了接受AFM分析由热导致和压力导致的细丝状肌浆球蛋白凝胶中的串珠结构和弹性之间的关系。近期消灭的阶段成像,力调制模式等新技术,使AFM能够定量测定物质弹性。AFM也应用于分析蛋白分散动力学。Yay等20使用AFM分析接受GDL导致不同大豆蛋白分散的过程。将11S、7S、2S在100加热10 min后,加入GDL,接受AFM观测它们形成不同的分散曲线。单位

10、时间内, 11S形成体积最大的分散团, 2S形成的分散团其次, 7S的分散团最小,所以可以推想11S的分散速度最快, 7S最小。虽然AFM已经成功地运用于食品蛋白凝胶领域,但是对于观测高度简单的真实食品体系,还存在不足,有太多其他组分和组分间相互作用会干扰对调查对象的分析。但是随着技术的进展,AFM必定会广泛的应用于真实的食品体系。2CSLM用于蛋白分散凝胶与传统的荧光显微镜相比,由于接受自动的显微镜技术、荧光探针技术、高容量和高强度的图片处理软件等先进技术,CSLM具有很高的放大倍数和高的辨别率。CSLM已经广泛的应用于分子生物学21、免疫学、药剂学22、基因学、生理学23等领域。2. 1C

11、SLM的原理利用激光束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT) ,再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。CLSM接受共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了1个带有小孔的挡板,平面以外的杂散光被拦住,消退了球差,并进一步消退了色差,且可将样品分解成二维或三维空间上的很多点,用格外细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成1个平面的或立体的图像24-25。2. 2CSLM的特点CSLM已经渐渐用于食品微结构的争辩,有如下特点26:避开固定或者脱水操作,避开破坏样品,因此削减了样品制备的时间和对样品性质的转变;荧光探针的

12、使用可以特定观看食品的某种成分,提高检测的灵敏性和特异性;食品结构的变化可以连续的监测;“光切片”技术可以确保不破坏微观结构的条件下,观测表面以下不同深度切面的微观结构。虽然CSLM有诸多优点,但是CSLM还有以下缺点:受衍射极限的限制, CSLM观测某些蛋白和酪蛋白胶束的辨别率最高达到0. 2m以上;同时某些与样品接受共价键结合的荧光探针会转变样品结构的影响27。此外,荧光信号渐渐减弱,会影响测定结果;扫描速度慢,并且目前CSLM不能检测静止的食品体系。2. 3CSLM在蛋白分散凝胶中的应用由于CSLM适宜观看处于自然状态下食品体系28,所以CSLM已经用于分析食品胶体,如蛋白-多糖相分别,

13、蛋白凝胶结构,乳化和泡沫稳定性29-34。CSLM可以用于测定胶体形成动态过程26。CSLM已经观测了接受凝乳酶导致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝胶的过程。起初,酪蛋白呈现出粒径小于0. 5m微小分散的小颗粒, 15 min后,酪蛋白颗粒开头发生分散,最终凝胶形成三维网络结构。从CSLM分析发觉,除了在低脂牛奶中脂肪球个数远少于全脂牛奶和凝胶速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝胶过程相像。接受CSLM观测GDL导致的凝胶过程时,发觉在加入GDL后1-20 min(pH 6. 515. 64),一些粒径小于1m蛋白微粒在各个方向上随机快速运动, 30 min后, pH下降到5. 58时,粒径小于

14、2m牛奶蛋白的分散体成为体系的主体。开头发生凝胶化并形成可见的蛋白网络是在pH 5. 4,而此时蛋白已经完全静止。CSLM能够清楚的描述在分散凝胶过程中大分子之间的相互作用,如多糖蛋白、蛋白蛋白。Sittikijyothin等35使用CSLM争辩由-乳球蛋白和他拉胶形成的混合胶。单纯的-乳球蛋白凝胶呈现均质性,而混合胶具有两个相。-乳球蛋白发生分散后,形成富含蛋白的连续相,他拉胶构成分散相。他拉胶浓度显著影响混合胶的微观结构,当增加他拉胶浓度时,会产生更具有开放性和不均匀的混合胶结构。GonCalves等36争辩由-乳球蛋白和刺槐豆胶形成混合胶也具有相像的结构36。Schmitt等37接受CS

15、LM争辩发觉:总浓度为1%的-乳球蛋白和阿拉伯胶,与总浓度1%的全溶-乳球蛋白和阿拉伯树胶形成的凝胶完全不同。球状混合聚集物的沉淀平衡系数受构成聚集层的两种物质比例的影响。当蛋白浓度上升时,产生尺寸巨大、数量众多沉淀,这些沉淀由阿拉伯树胶包围的蛋白质分散团组成。而分散团由含有单个小泡颗粒(气泡表观直径410m)和含有泡沫颗粒(气泡大小相对均一,直径在24m)构成。在全溶-乳球蛋白和阿拉伯树胶形成分散体系中主要是含有单个气泡的颗粒团。产生不同微粒的缘由是:-乳球蛋白和全溶-乳球蛋白的分散性不同造成的。CSLM供应了加热乳清蛋白和-乳球蛋白可以形成简单的凝胶网络的证据。疏水相互作用和氢键诱导-乳球

16、蛋白分子吸附到乳清蛋白上39。这一点在CSLM的照片上可以清楚地看到二者的荧光信号重合在相同的区域。此外,CSLM还显示-乳球蛋白对于乳清蛋白凝胶结构的影响,当降低-乳球蛋白的含量时,形成的混合凝胶网络更均匀。动态CSLM也成功地用于分析环境因素如离子强度、pH、时间等对于凝胶结构的影响。接受动态CSLM可以清楚地观测到离子强度和pH对蛋白网络结构的影响。在低离子强度和高pH条件下, CSLM观测到酪蛋白形成带有大孔洞的粗糙网络结构,而在高的离子强度和低的pH条件下,形成蛋白网络比较均匀,孔洞尺寸较小39。这是由于酪蛋白在高离子强度下的去稳定化要慢于低离子强度,并且需要更低的pH条件来削减胶束

17、表面的电荷,所以形成凝胶的速度较慢,简洁形成结构精细的凝胶网络结构。3DWS用于蛋白分散凝胶DWS起源于传统的激光散射技术。由于多散射光子叠加,使传统的静态或是动态激光散射技术都不能用于高浓度的胶体体系,只能分析稀释的悬浊体系,其浓度大约0. 01%。而凝胶化、相分别和絮凝现象发生的浓度,都高于激光散射测量的浓度范围40。但DWS却可以用于混浊的胶体体系,因此,DWS可以用于争辩乳化剂、胶体、化妆品等领域。3. 1DWS的原理当激光照射到组成胶体的颗粒上时,导致发生共振和散射,而且散射光受颗粒运动状态的影响41。DWS测定的是在颗粒间发生多次散射光子,这时间子的运动途径可以看作随机运动或是散布

18、运动。因此,随时间变化的散射光强度直接与样品中颗粒运动状态有关,测定散射光变化,即可推出颗粒运动状态,进而得出分散的状态。DWS有两种构造类型:同侧型和穿透型,同侧型,收集器和检测器与激光放射源在同一侧;穿透型收集器和检测器与激光放射源在异侧,所以散射激光必需穿过整个悬浊样品,散射激光的强度较高。同侧型的缺点是有时收集的散射光没有发生足够散射,但是它具有激光能量低并且易于安装设备的优点,因此用于食品分散凝胶化的争辩。3. 2DWS的特点DWS可以在线测定未稀释或是未预处理过样品,得到分散颗粒的尺寸、空间相关性的信息。但缺点是:DWS不能用于已经完全形成的凝胶,由于此时颗粒已经完全静止,体系中没

19、有微粒移动,就不能用简单的相关函数来推导凝胶的信息。目前没有商业化DWS设备,只是一些试验室自制的DWS设备。因此,DWS的进展受软件和硬件的限制。3. 3DWS在蛋白质凝胶分散中的应用目前,DWS主要用于争辩初始状态下的食品分散凝胶化过程,如通过添加凝乳酶或酸化导致牛奶凝胶化过程,并测定凝胶网络的黏弹性42-44。争辩表明,DWS能够精确测定分散时间,并且能找到散射光强度变化和形成结构弹性之间的联系。DWS通过测定光子运动平均自由行程(l*)的变化,发觉使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝胶差异明显。参数l*是穿透性DWS特有的表征微观结构进展变化和不同类型凝胶形成机理的指标。凝胶化过程中,l*的变化要早于颗粒分散尺寸变化和流变学变化。在酸化和凝乳酶诱导的凝胶体系中,随时间变化,两者的l*不同,所以证明在两种凝胶化过程中蛋白质间不同的相互作用类型45。即使在发生分散之前,DWS显示在光子平均自由行程上加热和未加热的牛奶有明显的差别