地菇菌栽培技术

1、地菇菌栽培技术一、 食用菌（微生物）的培养成败的关键消毒灭菌。消毒灭菌:可切断传播途径、控制感染扩散造成的危害；也可杀灭物品或器皿上的细菌，防止感染；是保证不受外来微生物污染的前提。 1常用术语：（1）灭菌 是破坏和去除物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）和细菌芽胞的方法。如外科器械、注射器、基础培养基灭菌等。 （2）消毒 是破坏物体上活的病原微生物的方法，但不包括细菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡体温计、洁而灭液擦拭检查台等。用于消毒的化学物品称消毒剂(disinfectant)。一般而言,消毒对象是指物体而不是机体。 （3）防腐 直接使用防腐剂(antiseptics)破

2、坏或抑制活病原微生物方法。如实验前碘液或酒精擦洗皮肤、双氧水清创伤口或杀菌肥皂清洗双手等应当使用该术语。 （4）无菌 防止感染病原体进入灭菌组织或物品的操作技术称无菌操作，无菌即为不存在活微生物。 2物理消毒灭菌法 （1）热力消毒灭菌法 利用高热使蛋白质分子运动加快，肽链连接键断裂，蛋白变性凝固，细胞膜功能受损致胞内物质漏出，细菌内外环境平衡失调，从而导致微生物死亡。不同种类微生物对热的耐受力不同，有芽胞细菌对高温有强的抵抗力。热力灭菌分干热灭菌法和湿热灭菌法两大类，相同温度下，湿热环境中菌体蛋白易凝固，穿透力比干热大，其蒸气变为液态时可释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度。1）干热灭菌法 包括

3、：焚烧：直接点燃或在焚烧炉内进行，仅适用于废弃物品或动物尸体。烧灼：直接以火焰灭菌，适用于微生物学实验室接种环、针和试管口等灭菌。干烤 在干烤箱内进行，加热至15018024h达到灭菌效果，适用于高温下不变质、不被破坏和不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用于塑料、棉、纸制品。 2）湿热灭菌法 包括：巴氏消毒法：是用较低温度杀灭液体中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐热成分的方法。大多采用71.6加热15秒，用于牛乳消毒。煮沸法：在一个大气压下，煮沸后的水温度达100，煮沸5min后可杀死一般细菌繁殖体。流通蒸气消毒法：又称常压蒸气消毒法，常用阿诺(Arnold)流通蒸气灭菌器或蒸

4、笼，利用1个大气压下100水蒸气进行消毒，1030min后细菌繁殖体被杀死，但对芽胞作用不大。间歇灭菌法：采用间歇方式达到灭菌目的。将灭菌物品置于阿诺流通蒸气灭菌器内，100加热1530min，每日一次，连续三次。每次灭菌后取出物品置37孵育箱过夜，致残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气灭菌器加热而被杀灭。如此反复以达到杀灭芽胞又使不耐高温的物质免受影响。常用血清凝固器对吕氏血清培养基和鲁琴培养基的灭菌属此方法。高压蒸气灭菌法 利用密闭的耐高压蒸气灭菌器(autoclave),在蒸气不外溢的条件下，使锅内压力增高，随之蒸气温度也增高。通常在103.4kpa压力下蒸气温度达到121.3,

5、维持1520min可杀灭所有的繁殖体和芽胞。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。 （2）辐射法 1）电离辐射 能产生电离辐射效应的有X射线、射线、阴极射线。受照射后，敏感的靶物质如细菌DNA吸收了射线产生能量，产生较大范围的突变，或产生毒性物质如自由基可破坏微生物核酸产生致死作用。电离辐射由于灭菌时不产生热量又称“冷灭菌法”，适用于对热敏感的物品及化学物质的灭菌,如一次性医用塑料制品和移植组织（骨、皮肤、心瓣膜等）和食品灭菌。 2）非电离辐射 紫外线 杀菌紫外线波长为240280nm，它作用于DNA链上相邻两个胸腺嘧啶或胞嘧啶，共价结合形成二聚体而干扰DNA复

6、制与转录，导致细菌的死亡。紫外线穿透力弱，故常用于空气消毒和不耐热物品表面消毒。 微波 是波长为1103 nm的电磁波，可穿透玻璃、陶瓷、塑料薄膜等物质，常用于检验室用品、食品食具、药杯及其他用品的消毒。 （3）声波 超声波的空化作用破坏了细菌原生质胶体状态导致细菌裂解。革兰阴性菌对其敏感。主要用于细菌细胞粉碎以提取细胞的组分或制备抗原。 （4）滤过除菌法 以物理阻留的方式将液体或空气中的微生物除去以达到无菌目的。用于不耐高温物品如血清、抗毒素、抗生素等的灭菌，超静工作台和层流室空气也用滤过法除菌。 3化学消毒灭菌法 化学药物使菌体蛋白变性沉淀、干扰微生物酶系统影响其代谢和损伤细菌细胞膜，导致

7、菌体内容物漏出，而发挥防腐、消毒和灭菌作用。只能外用或用于环境物品的消毒。 （1）化学消毒剂的种类： 1）根据化学结构与性质不同分类 可以分成酶类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂、染料、酸碱类等。 2）根据杀灭微生物作用强弱分类： 高效消毒剂 可杀灭一切微生物。如戊二醛、甲醛、环氧乙烷、过氧乙酸等。 中效消毒剂 杀灭除芽胞以外的微生物。如乙醇、碘伏等。 低效消毒剂 不能杀灭芽胞、结核分枝杆菌。如氯己定、苯扎溴铵等。 （2）影响消毒剂效能的因素 通常消毒剂的浓度和作用时间与消毒剂杀灭微生物的效能成正相关，但也有例外，如乙醇，其浓度为7075%时杀菌力最强。影响消毒剂作用的因素有消毒

8、剂的性质、浓度和作用时间；微生物的种类与数量；温度与湿度；酸碱度；环境中有机物存在的拮抗；其他化学拮抗物质。 （3）常用化学消毒剂的应用 卤素化合物 是有效的杀菌和灭菌剂，用于水、食品、设施消毒。如碘伏常用作于皮肤的除菌。 酚类化合物 是强效杀菌剂，通常用于物品消毒。 醇类 一般起抑菌作用。 过氧化氢 用于伤口防腐和器具消毒。高浓度的过氧化氢有杀灭芽胞性能。 表面活性剂 用于皮肤粘膜除菌和器具消毒。 醛类 破坏微生物酶系统，有潜在灭菌作用。 烷化剂 具高效的杀菌性能，是高效杀菌剂。二、 培养基（一）、培养基种类：由于各种所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种不同的培养基，

9、这些培养基可根据所含成分、物理状态、以及不同的使用目的等而分成若干类型。 1.按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。 (1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。 (2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。 (3)半合成培养基。在天然有机物的基础

10、上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 2.按照培养基的物理状态分 培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。 (1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。 (2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。 (3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半

11、固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。 3.按照微生物的种类分 培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。 常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。 4.按照培养基用途分 培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。 (1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。 (2)选择性培养基。

12、是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 (3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物三、培养基的制备过程：计算称量溶化灭菌倒平板（记忆）一般培养基的程序主要可分为：配料、 溶化、矫正pH 、澄清过滤、分装、灭菌及检定等8 个步骤。（一） 配料按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成 分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。（二） 溶化将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶

13、化应随时搅 拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。（三） 矫正pH1pH 测定取 与标准管同口径的试管 （通常用华氏试管）3 支，于第1 、3 管各加入欲测定pH 的的培养基5ml，并于第一管中加入02gL 的酚红025ml 作为测定管，混匀；于第2 管加入蒸馏水5ml ，第4 管为pH 标准比色管，分别按图59 1 插入比色架内进行比色。2pH 的校正若测定管过酸或过碱可用01molL 氢氧化钠或01molL 盐酸溶液矫正，直至颜色 与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1 滴后要充分混匀，比色后再加第2 滴 （有时仅加半滴） 准确记录加入的量。3计算设5 m

14、l 培养基矫正pH 至74 时需01molL 氢氧化钠015ml，现有培养基4990 ml ， 需加氢氧化钠的量可按下列方法计算：54990 015XX 015 ×4990/51497 （ml）如将此01molL 的氢氧化钠改用1molL 的氢氧化钠时，则需149ml 即可。（四） 过滤澄清培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过 滤方法如下：1液体培养基液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加 入用水稀释的鸡蛋白 （1000ml 培养基用1 个鸡蛋白） 在100 加热后保持60 70 40 60 分钟，使其不溶性物质附

15、于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以 滤纸过滤。2固体培养基如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压 （10343kPa） 蒸汽 融化15 分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。（五） 分装1根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容 器的23 以免灭菌时外溢。2琼脂斜面分装量为试管容量的15 ，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管 长的23 。3半固体培养基分装量约为试管长的13 ，灭菌后直立凝固待用。4高层

16、琼脂分装量约为试管的13 ，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。5液体培养基分装于试管中，约是试管长度的13 。6 琼脂平板：将灭菌 （或加热融化） 后的培养基冷至50 左右，以无菌手续倾人 灭菌平皿内，内径9cm 的平皿倾注培养基约13 15ml ，轻摇平皿底，使培养基平铺于平 皿底部，待凝固后即成，倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌 落入。新制成的平板培养基 （简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将 平皿倒扣搁置于37 培养箱内约30 分钟待平板平面干燥后使用。平板的放置：倒置。（原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置

17、，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。）（六） 灭菌不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。 高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别，一般培养基少量分装时高压 （10343kPa） 灭菌15 分钟即可，培养基分装量较大时，可 高压 （10343kPa） 灭菌30 分钟，含糖的培养基高压 （5516kPa） 灭菌15 分钟。以免糖 类被破坏。（七） 检定每批培养基制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37 温箱内培养24 小时 后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求 者方可使

18、用。（八） 保存制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作 日期等，放在4 冰箱内备用（短期保存）。长期保存：甘油管藏法（在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存）。四、平菇菌种制作技术（一）.平菇母种的制作 平菇母种配方：土豆 200 克、白糖 20 克、琼脂 20 克、水 1000 毫升、蛋白胨3克、硫酸镁 2 克、维生素 2 克。按配方精确称取，先将土豆去皮切片放入 1000 毫升水中，用文火煮沸 20 分钟左右。然后过滤，加水再加热，先将琼脂、白糖、硫酸镁、维生素煮至全部溶化，用量

19、杯量一下是否还够 1000 毫升，如不足，用开水补足。趁热分装试管中，每管装 12毫升， 1000 毫升可分装 80-100 支试管。分装时要用长管 漏斗，不要使培养基沾到试管口上，以免沾湿棉塞污染杂菌。塞棉塞要用普通棉花，塞 入试管要松紧合适。然后，每 10 支试管用皮套捆成一小捆，每 5 小捆再捆成一大捆，棉塞用牛皮纸包好，放入高压锅中 1.2 公斤压力，灭菌 30 分钟，停火。等 压力表回零才能排气开锅，取出试管倾斜排放在桌面上，斜面试管有两种：原母种试管 - 斜 面长度应为管长的 1/3 ，生产母种试管的斜 面应为管长的 1/2 ，冷却凝固后，取一些试管放入恒温箱中 27-30 度空白

20、培养 5天，经无菌观察，确认无杂菌，才能大量用于分离制种或转接生产母种。接种要在严格的无菌条件下进行可以使用甲醛加高锰酸钾消毒法，接种后放入 25 度的恒温箱中培养 7-10 天，长满试管确认无任何杂菌，就可用于转接二级原种了。 （二）.平菇原种制作 配方 1 ：阔叶木锯沫 80 斤、玉米面 25 斤、克霉灵 1 两、白糖 1 斤、硫酸镁 5 两、磷酸二氢钾 3 两、石膏1 斤、碳酸钙 1 斤。含水量 65% 。配方2 ：玉米芯 80 斤、稻糠 15 斤、夫子 10 斤、克霉灵 1 两、白糖 1 斤、硫酸镁 5 两、磷酸二氢钾 2 两、尿素 3 两、石灰 2 斤。含水量 65% 。配方 3 ：

21、阔叶木锯沫 40 斤、玉米芯 40 斤、豆饼粉 10 斤、玉米面 10 斤、白糖 1 斤、克霉灵 1 两、硫酸镁5 两、菇丰素 15 克、二氢钾 3 两、碳酸钙 1 斤、石灰 1 斤。 含水量 65%.配方 4 ： 玉米 100 斤，磷酸二氢钾 0 。 5 斤，硫酸镁 0 。 5 斤，白糖 1 斤，碳酸钙 2 斤， 629 消毒剂1 瓶。拌料：先将主料和夫子或玉米面、石膏、白灰干拌均匀。然后将其它药品溶化于水中，形成浓的原液。然后把原液均匀加入水中拌入料里。拌匀、含水量掌握在 65% ，即拌完料后用手握一把料，手指缝有水滴但不下落。最好用“亚泰牌装袋机”拌料，节省劳力、搅办均匀，而且还可以装多

22、种规格的菌袋，一机多用。装瓶标准： 每瓶能装干料 2.5 两，装完湿料连瓶称重应为 1.1 斤，这就证明装料量、松紧度都要适度。料中间打一个眼以利菌丝快速生长，装完瓶后马上擦净瓶身，盖上丙烯塑料，套好皮套，进行高压灭菌 1.5 公斤压力保持 2 小时以上。灭菌结束后，瓶温降到 30 度以下搬入接种箱中，接种前必须进行严格消毒 - 用 629 消毒剂或气雾消毒盒或电子接种器配合使用。一支生产母种可转接 5-8 瓶二级种，接完后马上放入 25-27 度的恒温箱中培养，没有恒温箱也可以放在能保持 25 度条件下培养。每 3-5 天检查一次，把长势不好、不纯的及时挑出。经 25 天左右培养，就能长满瓶

23、，满瓶后应再巩固培养 5 天，才能转接三级种。二级种可采用12*24丙烯袋装,因为罐头瓶不好买,大规模制种都有采用塑料袋.原种制作要领：料要干，无变质，加入原料必须精确，灭菌必须达到杀死一切微生物。接种要在绝对无菌条件下进行，盖瓶塑料必须用聚丙烯塑料，因为丙烯塑料比玻璃还透明，就是有小米粒大小的杂菌，也能清楚的观察到。 （三）.栽培种的制作 栽培种配方可完全参照二级配方和制作方法，但培养基营养配比应接近于栽培料，使菌丝有一个更适应的过程.栽培料配方:配方1：棉子壳 100 斤，石灰 4 斤，硫酸镁 4 两，克霉灵 1 两 ,尿素0.5斤,二氢钾3两,玉米面10斤,含水量65% 。配方2：棉子壳

24、 100 斤，石灰 1.5 斤，石膏 2 斤，克霉灵 1 两，高锰酸钾 1 两。配方3：棉子壳 100 斤，生石灰 3 斤，磷肥 1.5 斤，尿素 2 两，硫酸镁 3 两，克霉灵 1 两，碳酸钙 1 斤。配方4：玉米芯 100 斤，玉米面 25 斤，高锰酸钾 1 两，克霉灵 1 两，磷酸二氢钾 3 两，尿素 3 两，复合肥肥 3 两，硫酸镁 4 两，碳酸钙 1 斤，石灰 4 斤，菇丰素 15 克，大粒盐 1 斤（发酵料添加）。配方5：玉米芯 100 斤，夫子 15 斤，米糠 20 斤，克霉灵 2 两，尿素 5 两，磷酸二氢钾 3 两，硫酸镁 5 两，石灰 3 斤，石膏 1 斤，增产素 1 支，

25、大粒盐 1 斤（发酵料用）。配方6：花生壳粉 65 斤，玉米芯 35 斤，玉米面 5 斤，黄豆粉 10 斤，磷酸二氢钾 5 两，石灰 3-4 斤，克霉灵 1-2 两，过磷酸钙 5 两，硫酸镁 4 两。配方7：豆秸粉 50 斤，木屑 30 斤，玉米芯 20 斤， 夫子 13 斤，玉米面 10 斤，石灰 4 斤，克霉灵 2 两，过磷酸钙 5 两，尿素 4 两，硫酸镁 5 两，菇丰素 15 克，碳酸钙 1 斤。配方8：玉米芯 100 斤，玉米面 10 斤，黄豆粉 10 斤，米糠 5 斤，尿素 5 两，复合肥 3 两，硫酸镁 3 两，石灰 3 斤，过磷酸钙 1 斤，克霉灵 2 两。配方9：木屑 87%

26、 ，夫皮 5% ，玉米面 5% ，石灰、石膏、磷肥各 1% ，克霉增产灵 0.1% 。配方10：豆秆、木屑混合物 80 斤，夫皮 10 斤，鸡粪 5 斤，玉米面 5 斤，豆饼 5 斤，石灰 4 斤，磷肥 1 斤，尿素 3 两，克霉灵杀菌剂 2 两，碳酸钙 1 斤，硫酸镁 5 两,发酵期15-20天。 五平菇栽培料拌料要点： 1 料要新，不能有发霉、成团、虫卵等。2 主料以复合料为好，养份全、透气性好，有利于菌丝生长，确保高产。即使是单一的使用一种主料如玉米芯，也要注意料的粗、细。 料、水比例，不同的原料在栽培时加入的水量是不同的，不能只根据以往的某一经验一成不变。如棉子皮不脱绒时，料水比在 1

27、 ： 1 . 5 ，而脱绒的棉子皮在加水时，料水比在 1 ： 1 .3 左右。另外，原料的干、湿程度，原料的颗粒大小都影响拌料时的加水量。再有，质的不同的原料吃水程度也不同，玉米芯原料拌完后 2 小时左右才能吃透水，也就是说，要在拌完玉米芯主料闷 2 小时后，用手紧握一把料，手指间有水珠但不下落即为含水量 65% 。3 为达到主料与辅料等混合均匀，要先把主料、夫皮、玉米面、石灰、石膏干拌均匀，再把肥料、微量元素、杀菌剂、增 产剂溶于水中再均匀的加入主料中。一般发酵料在第二次翻堆时加入杀虫剂。另一个方法是干拌法,把所有的辅料都拌在一起,然后撒在主料的表面,干拌两遍,再向料堆加清水,省工,快速,均

28、匀。六、地平菇培养过程和要点菌床播种培养收获菌床处理1、菌床的制作过程：干稻草（1吨）用30%生石灰（200Kg生石灰、500Kg清水）左右浸泡三天。整理地面：1米宽、10米长、0.3米深。地面要平、土壤要丰富。用生灰散一层，然后喷散高锰酸钾溶液（浓度应为）。上铺用生石灰浸泡的稻草（厚5厘米左右）然后散上一层生石灰，再一层稻草，一层生石灰，如此反复6次。2、播种：把上面第一层稻草的1/2揭开散上2厘米大的栽培种3-5个，距离5-8厘米，复原稻草。喷洒0.1%高锰酸钾溶液。盖上薄膜。3、培养：前三不管。每天把薄膜揭一下，盖上，补充氧气。4、收获。摘在留小。注意不要污染菌床。5、菌床处理。生石灰散

29、菌床，深翻土。附录：1、 微生物计数显微镜直接计数： 1.1学习接目测微计的校正方法， 了解血球计数板的构造和计数原理 1.2 学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小， 掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。 2.0原理 微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。 显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。后者可直接用于测量细胞大小。它是一块.圆形玻片(图71)，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像

30、的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。镜台测微计是一块中央有精确刻玻片(图71)，刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。 3.0 材料 3.1 器械 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。 3.2 菌种 培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。 3.3 革兰氏染液 4.0流程 4.1 置目测微计置台测微计

31、标定目测微计测菌体大小记录结果用毕擦拭干净 4.2 检查计数板稀释样品加样计数计算清洗 5 步骤 5.1 微生物菌体大小的测定 5.1.1 目镜测微尺的校正 5.1.1.1 更换目镜镜头 更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。 5.1.1.2 某一倍率下标定目镜刻度 将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。记录两重叠刻度

32、间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数(图7-1C)。 5.1.1.3 计算该倍率下目镜刻度 目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um 5.1.1.4 标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度 以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。 5.1.2 菌体大小的测定 5.1.2.1 将啤酒酵母制成水浸片。 5.1.2.2 大小换算 将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。 5.1.2.3 求平均值 一般测量

33、微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。 5.2 用血球计数板测定微生物细胞的数量 5.2.1 检查血球计数板 取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。 5.2.2 稀释样品 将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含45个菌体的稀释度为宜。 5.2.3 加样 取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让

34、菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置510分钟。 5.2.4 镜检 待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央五个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。 5.2.5 计算 取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。 菌体细胞数（cfu/mL）小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数 5.2.6 清洗 计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸

35、泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。 图7-2 血细胞计数板 6 结果 6.1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。 6.2 记录菌体大小的测定结果。 6.3 计算样品中酵母菌浓度。 7 思考 7.1 为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？能找出这种变化的规律吗？ 7.2 根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？ 7.3 能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？ 7.4 根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？如何减少误差？ 8.0备注 目镜测数尺有两种：一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或

36、100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5 mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(图7-1A)，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。 血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计数用(图7-2A)，此区的长和宽

37、各为1mm。中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm3，容积为10-4ml。通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小格，每小格容积为4×10-6ml，即lml菌液容积相当于400万个小格体积。因此只要将细胞悬液注人计算室，计算出一定数量小格的平均菌数即可算出每毫升的细胞数。显微镜直接计数法基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 01mm2），

38、所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都

39、是相同的，即16×25=400小方格，如图-2。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为01mm，所以计数室的容积为01mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3， （即0.1mm3中的细菌总数）=A*B*25/5 故1ml菌液中的总细菌数=A*25*10*1000*

40、B/5 =50000A·B（个）二、器材酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。三、操作步骤1稀释将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太

41、稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。四、实验报告 平板菌落计数法一、基本原理平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞

42、繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。二、器材大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。三、操作步骤1编号：取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、

43、10-5、10-6各3套。另取6支盛有45ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2稀释用1ml无菌吸管精确地吸取05ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸05ml放入10-2试管中，吸吹三次，其余依次类推。整个稀释过程如图-3。3取样用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液02ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。4倒平板于上述盛有不同稀释度菌

44、液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约1015ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37温室中培养。5计数培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度

45、中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。平板菌蓓计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于 37温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取 02ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上2030分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37的温室中培养。四、实验报告 环境因素对微生物的影响微生物的生命活动要求一定的外界环境条件，外界环境条件适宜时，微生物进行正常生长繁殖；不适宜时，则会使微生物生长

46、受到抑制或发生变异，甚至死亡。不同的环境因素对微生物的影响不同；同一因素因浓度或作用时间不同，对微生物的影响也不一样；有的因素对某些微生物来讲是必需的，而对另一些微生物又是有害的，如好氧微生物必须在有氧条件下才能生长繁殖，而厌氧微生物在有氧情况下将会受到抑制。在有害因素中，有的起抑制作用；有的表现为杀菌作用。本实验通过化学、物理、生物和营养等环境因素对微生物影响的了解，以便为有益微生物创造适宜的生存条件，而对有害的微生物则设法控制或杀灭，使微生物能更好地为人类所利用。 生物基本知识->实验三十三 化学因素对微生物的影响 化学因素对微生物的影响一、基本原理常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐

47、类，酚、醇、醛等有机化合物以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质变性，或者与酶的SH基结合而使酶失去活性所致。本实验是观察某些常用的化学药品在一定浓度下对微生物的致死或抑菌作用，从而了解它们的杀菌或抑菌性能。为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。二、器材大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

48、，25碘酒，01升汞（HgCl2），5石炭酸，75酒精，1来苏尔，025新洁尔灭， 0005龙胆紫，005龙胆紫；培养皿，滤纸片，试管，吸管等。三、操作步骤1各种化学药品的杀菌作用(1)用无菌吸管吸取培养18小时的白色葡萄球菌菌液02ml于无菌平皿内。(2)倒入已溶化并冷至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于上述平皿内，充分摇匀，水平放置，待凝。(3)将上述已凝固的平皿用记号笔在平皿底划成八等份，每一等份内标明一种药物的名称。(4)用无菌镊子将小圆形滤纸片分别浸入各种药品中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内，如图-1。(5)将上述放好滤纸片的含菌平皿，倒

49、置于37温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。2石炭酸系数的测定（1）将5（1：20）的石炭酸液按表-1配成不同浓度，每管5ml。（2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表-2配成不同浓度，每管 5ml。 （3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，115管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，1630管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。 （4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入05ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培

50、养基试管中。（5）置37温室中培养 48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。（6）计算系数值 找出在5分钟生长，而在10分钟和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=36。四、实验报告 实验三十四 氧对微生物的影响一、基本原理各种菌对氧的要求是不同的，根据它们对氧的要求或所能耐受的量可将细菌分为四个类型。专性好氧菌必须在有氧的情况下生存，例如枯草芽孢杆菌；专性厌氧菌则要求在完全无氧的条件下生长繁殖，分子氧对它

51、们有害，例如破伤风梭菌（Clostridiumtetani）、丙酮丁醇梭菌（Cacetobutylcum）等；兼性厌氧菌无论在有氧或无氧的情况下均能生长，一般在有氧情况下生长快，例如酵母菌、肠道杆菌等属于兼性厌氧菌；微好氧菌适宜于在氧浓度较低的环境中生长，例如链球菌属中的个别种。本实验采用深层琼脂法来测定氧对细菌生长的影响，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基试管中接入某种细菌，通过适宜的培养条件，若细菌只生长在培养基表面，则为好氧菌；只生长在培养基底部，为厌氧菌；若表面及全部培养基中都生长，为兼性厌氧菌；生长在培养基中上部，为微好氧菌（图-2）。这样，根据细菌在试管培养基中生长的部位，就可以判断各

52、种细菌对氧的需要程度。二、器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，丙酮丁醇梭菌；肉膏蛋白胨琼脂试管培养基4支。三、操作步骤1将肉膏蛋白胨琼脂培养基试管置于水浴锅中加热溶化。2待培养基冷却至50左右时，按无菌操作分别用接种环接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌各一环于试管培养基中，另一支试管中不接种作对照。搓动试管，使细菌均匀混于培养基内。3待凝固后，置于28温室中培养48小时后开始观察，连续观察几天，直至结果清晰时为止。四、实验报告 实验三十五 温度对微生物的影响基本原理温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长的作用；不适宜的温度可以导致细菌的形态和代谢的改变或

53、使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。不同的微生物对温度的抵抗力不同，如大肠杆菌在6010分钟内致死，而枯草芽孢杆菌在100617分钟内才能致死，这是因为芽孢不仅含水量低，有厚而致密的壁，而且还含有特殊的物质吡啶二羧酸，所以芽孢杆菌的抗热能力比大肠杆菌强。二、器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，吸管，恒温水浴，温度计等。三、操作步骤1将培养48小时的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面加入无菌生理盐水各5ml，用接种环刮下菌体，制成菌悬液。2取肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，从1至16编号并注明各管所接菌种的名称和处理的温度及时间。3在单号1、3、5、7、9、11、13、15管中各接入大肠杆菌悬液02ml，在双号2、4、6、8、10、12、14、16管中各接入枯草芽孢杆菌悬液02ml。4将已接种的18管同时放入50水浴中，10分钟后取出第14管。再过10分钟（即处理20分钟）后取出第58管；同法将接过菌种的第916管同时放入100水浴中，10分钟后取出第912管。再过10分钟（即20分钟）后取出第1316管。5上述各管取出后，立即用冷水冲凉，然后置37恒温室内培养24小时后，观察生长情况。四、实验报告 渗透压对微生物的影响 一、基本原理若将细菌置于低渗液或水中，菌体因吸