DNA多态性分型技术2013

1、第三节第三节 DNA多态性分型技术多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院四川大学华西公共卫生学院 汪川汪川什么是DNA多态性?多态性（多态性（polymorphism）是指在一个生物）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性（态性（genetic polymorphism）或基因多态）或基因多态性。性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有

2、重要调节功能的区域。白的区域和没有重要调节功能的区域。DNA多态性对微生物有哪些实际意义？多态性对微生物有哪些实际意义？将导致将导致不同的细菌亚型不同的细菌亚型耐药菌株出现耐药菌株出现毒力变异株出现毒力变异株出现抗原漂移与抗原变异抗原漂移与抗原变异。在疾病预防控制中的应用在疾病预防控制中的应用同源性追踪同源性追踪细菌分型细菌分型传染控制传染控制DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术扩增片段长度多态性分析技术（自学要考）扩增片段长度多态性分

3、析技术（自学要考） 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳。一、限制性片段长度多态性分析一、限制性片段长度多态性分析restriction fragment length polymorphism，RFLP 以以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传杂交为基础的第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针术、探针-杂交技术的综合应用杂交技术的综合应用每种生物基因型具有其独特的特征，及每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限独特的限制酶识别序列分布制酶识别序列分布，其基因组，其基因组DNA在限制性内在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些切酶作

4、用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的同位素标记的DNA作探针，将与被标记的作探针，将与被标记的DNA相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。基基 本本 原原 理理因此，因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态性。变异性来检测生物体多态性。基基 本本 原原 理理基本基本方法方法 提取

5、基因组提取基因组DNA制性内切酶酶切制性内切酶酶切 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 DNA变性、转膜、固定变性、转膜、固定核酸杂交核酸杂交 显影、显色、分析显影、显色、分析限制性内切酶限制性内切酶(restriction endonuclease(restriction endonuclease， RERE） 一类能识别环状或线性双链一类能识别环状或线性双链DNADNA特定特定核苷酸序列的核苷酸序列的DNADNA水解酶，在合适反应条水解酶，在合适反应条件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。 内切

6、酶的命名规则内切酶的命名规则前三个字母代表其来源的细菌种名，用前三个字母代表其来源的细菌种名，用斜体字母，第四个字母代表菌株名称，斜体字母，第四个字母代表菌株名称，如果同一株菌有不同限制性内切酶系统，如果同一株菌有不同限制性内切酶系统，则不同的内切酶系用罗马数字区分。则不同的内切酶系用罗马数字区分。 例：例：EcoEcoRIRI代表该酶来源于代表该酶来源于E. coliE. coli的的R R菌株。菌株。 琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪转移电泳槽转移电泳槽核酸分子杂交的概念及原理核酸分子杂交的概念及原理核酸杂交核酸杂交: :两个不同来源的、含有互补核苷酸顺两个不同来源的、含有

7、互补核苷酸顺序的单股核酸分子，通过碱基配对形序的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程。成一个新的、稳定的双股分子的过程。 核酸经加热变性后，在低于变性温度核酸经加热变性后，在低于变性温度2020 3030时，反应系统中加入的时，反应系统中加入的核酸探针核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNADNA或或RNARNA形成双链结构，通过检测标记信号即形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。可检测特定的核苷酸片段。 核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理根据探针上的标记，可用放射自显影根据探针上的标记，可用放射自显影或

8、加入酶底物显色的方式观察结果。或加入酶底物显色的方式观察结果。优点优点1可靠性较高可靠性较高2来源于自然变异来源于自然变异 3标记覆盖面广标记覆盖面广优优 缺缺 点点缺点：缺点：检测步骤多，周期长；检测步骤多，周期长；对对DNA需求量大，一般需要需求量大，一般需要5l0g，纯度要求较高；纯度要求较高；技术复杂，操作繁琐，工作量大；技术复杂，操作繁琐，工作量大；具有放射性的危害；具有放射性的危害；检测成本高。检测成本高。讨论：讨论：RFLP与脉冲场凝胶电泳都是根据与脉冲场凝胶电泳都是根据基因组上的限制性内切酶位点的基因组上的限制性内切酶位点的多态性来对生物进行基因分型的，多态性来对生物进行基因分

9、型的，那么它们两者的异同点有哪些呢？那么它们两者的异同点有哪些呢？基于上述基于上述RFLP的缺点，一种更好的的缺点，一种更好的分析技术分析技术聚合酶链反应聚合酶链反应-限制性限制性片段长度多态性分析技术片段长度多态性分析技术 （PCR-RFLP ）应运而生。）应运而生。结合结合PCR技术与技术与RFLP技术的优点，其基本原技术的优点，其基本原理是对目的基因片段理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图

10、谱，通过对电泳图谱电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。的分析，得出基因多态性结果。思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？基本原理基本原理根据名称：根据名称： PCR-RFLP猜想本方法的原理？猜想本方法的原理？1. 提取提取DNA2. 设计特异引物进行目的基因设计特异引物进行目的基因PCR反应反应3. 将将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶扩增产物选用合适限制性内切酶酶切切4. 将酶切出来的具各种长度的将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼片段在琼脂糖凝胶上电泳分离脂糖凝胶上电泳分离5. 对显示出来的带谱进行分析。对显示出

11、来的带谱进行分析。 基基 本本 程程 序序根据基本原理思考基本程序？根据基本原理思考基本程序？优优 缺缺 点点 优点：优点：敏感性高。敏感性高。操作简便省时。操作简便省时。缺点：缺点：影响因素较多。影响因素较多。不能完全区分基因非常相似，甚至只有一不能完全区分基因非常相似，甚至只有一个核苷酸差异的生物类型。个核苷酸差异的生物类型。 RFLP与与PCR-RFLP的应用的应用 结核分枝杆菌结核分枝杆菌IS6110-RFLP分分析析 厌氧菌厌氧菌16SrRNA基因基因PCR-RFLP分析分析 其他其他 二、随机扩增多态性二、随机扩增多态性DNA分析技术分析技术random Amplified Pol

12、ymorphism DNA， RAPD 以以PCR技术为背景，以人工合技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的苷酸单链为引物，对所研究的基因组基因组DNA进行进行PCR扩增，经扩增，经电泳分离后产生电泳分离后产生DNA指纹图谱。指纹图谱。 模板模板DNA经经9294变性解链后，在较低温度变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链可扩增范围之内，且分别位于互补的

13、两条单链上，并且与引物的上，并且与引物的3端相对应，就可以通过端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。得到一个扩增产物。基基 本本 原原 理理RAPD所用的一系列所用的一系列DNA引物序列各不相同，但引物序列各不相同，但对于任意特定引物，它同基因组对于任意特定引物，它同基因组DNA序列有其序列有其特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使位点分布发生相应变化，而使PCR产物增加、产物增加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。减少或发生分子

14、量改变，产生多态性图谱。基基 本本 原原 理理总总DNA提取提取随机引物合成随机引物合成PCR扩增扩增随机引物筛选随机引物筛选电泳检测电泳检测图谱分析图谱分析采用随机引物，无需预先知道被研究生物采用随机引物，无需预先知道被研究生物基因组核苷酸序列；基因组核苷酸序列；引物短，在整个基因组内的结合位点多，引物短，在整个基因组内的结合位点多，2种甚至多种引物可混用；种甚至多种引物可混用；成本较低；成本较低；操作简便，快速；操作简便，快速；DNA分析效率较高；分析效率较高；所需所需DNA样品少。样品少。优优 点点重复性不高（最大缺点）；重复性不高（最大缺点）；只能区分不同大小的片段，而不能区分有只能区

15、分不同大小的片段，而不能区分有不同碱基序列但大小相同片段；不同碱基序列但大小相同片段；需对引物进行筛选，难以进行标准化。需对引物进行筛选，难以进行标准化。缺缺 点点三、细菌基因组重复三、细菌基因组重复序列序列PCRPCR技术技术（repetitive-element PCR, repetitive-element PCR, rep-PCRrep-PCR）一种基于一种基于PCRPCR的的DNADNA标记技术标记技术 rep-PCR rep-PCR技术是利用基因组中广泛技术是利用基因组中广泛分布的分布的短重复序列（短重复序列（repetitive repetitive sequences)sequ

16、ences)为引物进行为引物进行PCRPCR扩增，通过扩增，通过对对PCRPCR产物的电泳结果进行比较，来分产物的电泳结果进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异。析菌株间基因组存在的差异。rep-PCR-原理原理 目前研究最多、最常用的细菌基因组短目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有：重复序列有：rep-PCR-短重复序列短重复序列基因外重复回文序列基因外重复回文序列（Repetitive Intergenic Palindrome,REP)肠细菌基因间共有重复序列肠细菌基因间共有重复序列（Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus

17、, ERIC) 两者的两者的共同特征共同特征是它们在细菌基因组中是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的的保守性保守性。 基于这两种短重复序列的基于这两种短重复序列的PCR就成为就成为rep-PCR的的2个重要的技术个重要的技术REP-PCR和和ERIC-PCR。rep-PCR-短重复序列短重复序列两种短重复序列的特点及功能：两种短重复序列的特点及功能： 基因外重复回文序列（基因外重复回文序列（REP）又称回文单）又称回文单位，其结构特点是位，其结构特点

18、是回文性质回文性质，其转录的，其转录的mRNA有形成茎有形成茎-环（环（stem-loop）结构的潜能。）结构的潜能。 REP家族序列由家族序列由38bp构成，含有构成，含有6个非常个非常保守的位点及保守的位点及5bp构成的位于非常保守的回文构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环。臂之间的保守环。REP序列序列rep-PCR-REP序列序列 REP REP家族序列广泛分布在家族序列广泛分布在大肠埃希菌大肠埃希菌和和沙门菌沙门菌基因组内基因组内( (提示什么？）。提示什么？）。REPREP序列可以单独出现或增加为序列可以单独出现或增加为4 4个串联的重个串联的重复单位。在复单位。在E.coliE

19、.coli的染色体上，存在的染色体上，存在500500到到10001000个的个的REPREP串联重复单位，在沙门菌串联重复单位，在沙门菌上上REPREP串联重复单位约占基因组的串联重复单位约占基因组的1%1%。rep-PCR-REP序列序列REP序列的功能：序列的功能：rep-PCR-REP序列序列转录终止作用；转录终止作用；稳定稳定mRNA；在体内染色体区段的组织作用。在体内染色体区段的组织作用。 根据根据REPREP这段高度保守的重复序列设计这段高度保守的重复序列设计引物，扩增两段引物，扩增两段REPREP之间的片段，扩增产物之间的片段，扩增产物的的数量数量和片段和片段长短长短的不同就直

20、接反映了基的不同就直接反映了基因组因组DNADNA的差异，从而可对菌株进行分型和的差异，从而可对菌株进行分型和同源性分析，这就是同源性分析，这就是rep-PCRrep-PCR技术中的技术中的REP-REP-PCRPCR技术。技术。rep-PCR-REP-PCR技术技术 肠细菌基因间共有重复序列（肠细菌基因间共有重复序列（ERICERIC）长约）长约126bp126bp，其中包含几个反向重复序列，具有非，其中包含几个反向重复序列，具有非常保守的中央倒置重复区，转录后的常保守的中央倒置重复区，转录后的mRNAmRNA形成形成茎茎- -环结构。环结构。 当茎环结构中位于茎部位的一个碱基发生当茎环结构中位于茎部位的一个碱基发生改变时，与其相对应的碱基也要发生相应的改改变时，与其相对应的碱基也要发生相应的改变，从而保证二级结构的稳定。变，从而保证二级结构的稳定。rep-PCR-ERIC序列序列结构特点结构特点 ERIC序列的功能目前还不太清楚，在一序列的功能目前还不太清楚，在一些研究中，些研究中，ERIC被认为：被认