分子生物学与细胞生物学实验基本技术1

1、实验三 细胞传代一、目的学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、概述培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；局部贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心别离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、材料一仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱4、-205. 倒置相差显微镜6. 培养箱二玻璃器皿1. 吸管弯头、直头2. 玻璃瓶250ml、100ml3. 培养瓶4. 废液缸（三） 塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 15ml离心管5. EP管四其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板五试剂1. D-H

2、anks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗青霉素、链霉素5. 胰蛋白酶0.08%或EDTA或两者混合液6. 1NHCl7. 4%NaHCO3四、操作步骤（一） 贴壁细胞的消化法传代：1. 吸除或倒掉瓶内旧培养液。2. D-Hanks液洗23次。3. 向瓶内参加适量消化液胰蛋白酶或与EDTA混合液轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞外表，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大局部消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。4. 消化最好在37或室温25以上环境下进行。消化25min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后

3、，应立即终止消化。5. 吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。6. 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。 7. 计数，分别接种在新的培养瓶内。（二） 悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心传代法：1. 将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；2. 离心8001000rpm，5min；3. 弃去上清，

4、加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4. 计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/22/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)、局部贴壁细胞的传代局部贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大局部贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丧失，因而需消化后，才能吹打传代。五、考前须知1. 胰蛋白酶要预温，温度37左右为宜。2. 离心转速要适宜，转速过低，不能有效别离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3. 要定时观察细胞，发现污染，应及时

5、处理。审实验四 细胞冻存和复苏一、目的学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、概述细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的消耗，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的根本原那么是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性

6、，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，防止由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、材料一仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱4、-20、-705. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱二玻璃器皿1. 吸管弯头、直头2. 培养瓶3. 玻璃瓶250ml、100ml4. 废液缸三塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管10ml5. 15ml离心管6. 冻存管12ml四其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板

7、3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪五试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗青霉素、链霉素5. 胰蛋白酶0.08%6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO分析纯或无色新鲜甘油四、操作步骤一细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞那么直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，参加适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/m

8、l1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管11.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/ min；到-100时，那么可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二） 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37水浴中取出冻存管，翻开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4

9、. 弃去上清液，参加含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。五、考前须知1从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；2将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3冻存和复苏最好用新配制的培养液。审实验五 细胞生长曲线、四唑盐试验MTT比色试验一 细胞生长曲线一、目的学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长根本规律。二、概述：细胞生长曲线是观察细胞生长根本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验

10、中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为根本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。三、材料一仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱4、-205. 倒置相差显微镜6. 培养箱37、5%CO2、饱和湿度二玻璃器皿1. 吸管弯头2. 培养瓶3. 玻璃瓶250ml、100ml4. 废液缸三塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24培养板4. 胶塞四其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板五试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗青霉素、链霉素5. 0.08%胰酶四、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一

11、般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的培养瓶内或培养孔以24孔培养板为宜，每瓶或孔细胞总数要求一致，参加培养液的量也要一致。3. 每天或每隔一天取出3瓶孔细胞进行计数，计算均值。培养35d常要给未计数的细胞换液。4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴对数，描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。五、考前须知1 细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有2030%的误差，需结合其它指标进行分析。2 现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。3 标准的细胞生长曲线近似“S形，一般在传代后第一天细胞数

12、有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，到达平台期后生长稳定，最后到达衰老。4 在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。二、四唑盐试验MTT比色试验一、目的学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。二、概述四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT复原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。三、材料一仪器1. 净化工作台2.

13、离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱45. 倒置相差显微镜6. CO2培养箱7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪9. 移液枪10. 电磁力搅拌机11. 微孔滤器二玻璃器皿1. 吸管2. 小烧杯100ml3. 废液缸三塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 96孔培养板4. 15ml离心管5. 50ml离心管6. 胶塞四其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板五试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗青霉素、链霉素5. 0.08%胰酶6. 二甲基亚砜DMSO7. um的微孔滤器除菌，分装，4保存备用，两周内有效。四、操作步骤1. 接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养

14、细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37、5% CO2及饱和湿度条件下培养。培养时间取决于实验目的和要求3. 呈色：每孔参加MTT溶液5mg/ml20ul，37孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心1000rpm，5min，然后弃去孔内培养液。每孔参加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4. 比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制

15、细胞生长曲线。五、考前须知1 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2 防止血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。3 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。实验八核蛋白的免疫荧光定位一、目的学习免疫荧光定位技术，定位细胞核蛋白。二、概述 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的抗体(或抗原)作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射

16、，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原(或抗体)的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以到达对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。三、材料1. 荧光显微镜 2. 22×3. 载玻片4. 100%甲醇5. 1% normal goat serum (NGS) in PBS6. 一抗：鼠抗人增殖细胞核抗原抗体Proliferative cell nuclear antigen antibody, PCNA7. 二抗：FITC标记的羊抗鼠IgM四、操作步骤1. 在22×22mm的1.5号盖玻片上培养细胞。理想条件下细胞应长到50%-70%集合。2. 在-2

17、0用100%甲醇固定细胞3分钟。3. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。4. 在湿盒里以适当浓度的一抗室温温育1小时。如果用22×22mm盖玻片，那么在盖玻片上加30ul稀释的抗体，并且将盖玻片倒置在玻璃载玻片上，然后将载玻片放到湿盒里，在室温温育。5. 用PBS + 1% NGS洗三次，每次10分钟。6. 在湿盒里与稀释为4ug/ml的荧光标记二抗室温温育1小时。7. 用PBS洗四次，每次10分钟。8. 用封片剂将盖玻片封在载波片上，用干净的指甲油将盖玻片封边，防止盖玻片滑动。五、考前须知1. 要在盖玻片一边角落做记号，以知道细胞在盖玻片的那一面。2. 一抗的浓度需要

18、经过实验摸索确定。审实验九TOTAL RAN 提取一、目的 掌握RNA的提取过程二、概述有亚硫氢胍及巯基乙醇时，制组织匀浆，可使内源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸将核蛋白复合物变性。用酸平衡的苯酚：氯仿：异戊醇抽提后，RNA脱离DNA及蛋白，从混合液中层析到水相。抽提后，用异丙醇将RNA沉淀浓缩模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反响而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。三、材料及试剂1. Invitrogen TriZOLRNA 提取试剂

19、盒2. 异丙醇3. 70酒精4. DEPC5. 低温离心机四、操作步骤 1. 全血细胞：溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 16000 rpm离心20秒。弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。2. 组织细胞：将冻存或新鲜的组织，参加液氮让组织块完全冷冻，充分碾磨。参加1ml的TriZOL，分混匀，室温静置5min。3. 取106-7细胞参加1ml的TriZOL中，充分混匀，室温静置5min。4. 再参加200ul的氯仿，充

20、分混匀，室温静置5min。4，13000rpm离心15min。5. 取上清液500ul，参加等量的异丙醇。充分混匀室温静置5min。4，13000rpm离心10min。6. 弃上清液，参加75%的酒精500ul，4，13000 rpm离心10分钟 。7. 弃上清液，参加20ul的DEPC水，混匀。8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。五、考前须知所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换使用一次性手套。所用的玻璃器皿需置于枯燥烘箱中200烘烤2 小时以上。但凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用

21、0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反响而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC 处理,参加DEPC 至0.1%浓度,然后剧烈振荡10 分钟,再煮沸15 分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否那么DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但DEPC 能与胺和巯基反响,因而含Tris 和DTT 的试剂不能用DEPC 处理。Tris 溶液可用DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC 处理水配制,并尽可能用

22、未曾开封的试剂。除DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了防止mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。细胞内总RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。别离的总RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA 流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA 被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱

23、,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA 在70%乙醇中-70可保存一年以上。审实验十基因组DAN 提取一、目的 掌握提取DNA原理及方法二、概述 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中别离DNA 。 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在

24、低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法别离这两种核蛋白。苯酚/氯仿作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，屡次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DN

25、A保持天然状态，真核细胞DNA的别离通常是在EDTA及SDS一类去污剂存在下， 用蛋白酶K消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA提取试剂盒出售。三、材料及试剂1. GENTRO DNA提取试剂盒2. 异丙醇3. 70酒精四、操作步骤一、从全血中提取DNA1. 溶血：加300ul的肝素或EDTA二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min,期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 16000 g离心20秒。2. 弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。3. 加300ul的Cell Lysis Sol

26、ution于EP管中, 充分混匀。4. 加100ul的Protein Precipitation Solution于EP管中, 充分混匀。13000 16000 g离心3分钟 。5. 取上清液，加300ul的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 16000 g离心1分钟 。6. 弃上清液，参加70%的酒精500ul，13000 16000 g离心1分钟 。7. 弃上清液，参加DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，655分钟使DNA 完全溶解。8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。二、从组织中提取DNA9. 取液氮冷冻的

27、叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。10. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后参加缓冲液“S750ul, 充分混匀。11. 将离心管置于65水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。12. 取出离心管, 每管参加等体积的酚氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。13. 上清液移入另一离心管中，参加等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。14. 将上清液移入另一离心管中，参加倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70乙醇冲洗2次。15. 勾出的DNA，真空枯燥后将其溶于500ul 1x TE中。16

28、. 参加3ul RNA 酶溶液，37保温1 小时。 17. 参加等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。18. 取上清液，参加等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。19. 取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，参加2倍体积冷的无水乙醇或95乙醇。20. 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70乙醇冲洗2次后，真空枯燥。21. 依所提DNA量参加20-50ul的1x TE溶解DNA。22. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。23. 样品在4下保存备用。附: 提DNA 所用试剂配方：1. 1. 1M

29、Tris.Cl   (1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至后定溶至1升， 灭菌)2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调 pH至，定溶至 1 升)3. 20% SDS    (2L: 在2L热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)4. 5M NaCl (1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 灭菌)5. 5. 缓冲液“S 配1L缓冲液“S1) 100mM Tris.Cl pH8.5 1M T

30、ris.Cl 100ml2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml3) 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml4) 2% SDS 20% SDS 100ml5) H2O 680ml6. 100x TE (1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调 pH至8.0, 定溶， 灭菌)7. 50x TAE(1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加和冰醋酸，定溶)8. 蛋白酶K溶液的配制(用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K溶液

31、； 或用超纯水配制成相同的浓度)9. RNase (用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20下 保存)10. 10. 3M NaAc pH5.2   (1L: 600ml H2O中参加408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH至， 然 后定溶1L ，灭菌)五、考前须知不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA实验十二核酸纯度、浓度与分子量测定一、目的了解测定核酸浓度、纯度的原理和操作方法。二、概述凝胶电泳是别离和纯化DNA片段最常用的技术。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔

32、径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性条件下带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。线性DNA样品在凝胶中的迁移率与DNA的对数值成反比，可在电泳中参加核酸分子量标准来确定电泳后核酸的分子量。溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，在凝胶电泳中，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260 nm，在此波长下，吸光度1 A相当于一定浓度的核酸，可以通过A260/A2

33、80 的比值，来测定所得核酸的纯度。三、材料 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，点样板，微波炉，琼脂糖，TBE电泳缓冲液，TE buffer，溴化乙锭EB，载样缓冲液，紫外分光光度仪，凝胶图象分析仪等四、操作步骤一、紫外分光光度Spectrophotometer法：1. 将分光光度计翻开，预热10分钟。2. 将核酸溶液中取2µl，加或纯水使体积成为100µl。3. 将稀释溶液参加石英管，以TE buffer或纯水为标准倒入另一管。4. 在波长260、280nm处测定吸光值。5. 比拟在260nm及280nm之读值。三Ethidium bromide染色法：利用一系列不

34、同浓度的DNA标准溶液0、5、10、20、30、40、50 ng/ml，或浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳，以EB染色后，在凝胶图象分析仪上观察，比拟标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量；比拟DNA样品与DNA marker条带位置，推知DNA 样品分子量。实验步骤主要包括制胶、点样以及电泳等过程。 1. ×TBE电泳缓冲液三角瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。参加溴化乙锭EB至终浓度0.5ug/ml，并摇匀。 2. 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固。 3. ×TBE电泳缓冲液至

35、液面覆盖凝胶1-2mm。4. 用移液器吸取DNA样品8l与 2l 的载样缓冲液混匀，小心参加点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10l DNA Marker作为分子量标准。 5. 翻开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到条带由负极向正极移动，约半小时后即可观察。 6. 在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比拟被扩增产物的大小；同时比拟标准浓度及未知浓度的亮度，求取DNA 的含量。五、考前须知1、表示DNA/RNA的纯度高。假设数值，表示纯度低，这时由OD260测得的DNA含量较不可信，核酸溶液中含有较多蛋白质，因此最好将前述所得核酸再重新抽取。2. 测定26

36、0nm吸光值，代表值如下：1) ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml2) ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml3) oligonucleotide = 33 mg/ml3. EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验十五PCR及RT-PCR一、目的 掌握聚合酶链式反响(PCR) 及逆转录聚合酶链式反响(RT-PCR)的根本方法二、原理 PCR用于扩增位于两段序列之间的DNA区段。在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反响中，使用两段寡核苷酸作为反响的引物。

37、一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。反响时它包括三个根本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个根本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍图4,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可

38、使DNA 扩增达106 倍。 RNA的多聚酶链式反响RT-PCR是以RNA为模板，联合逆转录反响reverse transcription, RT与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。RNA扩增包括两个步骤：在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。 在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由

39、于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级别离，即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。RNA中即使含有极微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性扩增；蛋白质未除净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。硫氰酸胍GaSCN-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法为佳，适合一般实验室进行。常用的逆转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病病毒Avian myeloblastosis virus, AMV和莫洛尼鼠类白血病病毒Molon

40、ey murine leukemia virus, MO-MLV的逆转录酶RT。一般情况下用Mo-MLV-RT较多，但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时，可改用AMV-RT，因后者最适温度为72，高于Mo-MLV-RT的最适温度37，而较高的反响温度有助于消除RNA的二级结构。 一步法扩增one step amplification是为了检测低丰度mRNA的表达，利用同一种缓冲液，在同一体系中参加逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其

41、后的PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。三、材料一、仪器1. DNA扩增仪，亦称PCR仪2. 台式高速离心机3. 电泳仪、电泳槽4. Pharmacia Biotech公司的ImageMaster VDS凝胶成像仪二、塑料器皿Eppendorf管、Tip头三、其他物品1. 微量加样枪(0.510 ul、540

42、ul和40200各1支)2. Eppendorf管架四、DNA模板 含有靶序列的DNA可以单链或双链形式参加PCR混合液。虽然DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA(如基因组DNA)时，假设用切点罕见的限制酶(Sal I 或Not I)先进行消化，那么扩增效果更好，闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此用质粒作反响模板时最好先将其线状化，但这也不是非常必要。模板DNA中靶序列的浓度因情况而异，而且往往非实验者所能控制。尽管如此，仍值得按靶序列量递减(1ng、等)的方式设置一组对照反响，以检测扩增反响的灵敏度是否符合要求。五、试剂1. 10×PCR缓冲液(不

43、含MgCl2)2. 5mmol/LdNTPs,4种dNTP每种浓度均为3. Taq DNA聚合酶(5u/ul)4. MgCl2，25mmol/L5. 5×TBE电泳缓冲液6. 10g/L溴化乙锭7. 1%2%琼脂糖凝胶(浓度视待扩增的DNA片段大小而定)8. 两对套叠式引物四、操作步骤(一)、以DNA为模板的PCR扩增反响1. 按以下次序，将各成分在0.2ml Eppendorf管中混合：1) 模板DNA(100mg/L) 5.0ul 2) 10×PCR缓冲液 5.0ul 3) 4.0 ul 4) 引物(5端,30pmol/L) 5) 引物(3端,30pmol/L) 6) MgCl2(25mmol/L) 7) Taq 酶(5u/ul) 。8) 用灭菌双蒸馏水补足体积至50 ul 2. 将溶液混匀，15 000r/