羊肚菌专利全文

1、(19)中民*CN102174414A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(43)申请公布日CN 1021744142011.09.07A(21)申请号201010622986.8C12R1/645 (2006.01)(22)申请日2010.12.28(83)生物信息CGMCC 3899 2010.06.13(71)申请人 青海大学地址 810016 青海省西宁市宁大路 251 号(72)发明人(74)专利机构 北京北翔知识产权公司 11285人有限(51)Int.Cl.C12N C12P A23L A61K A61P A61P A61PA61P1/14 (2006.01)19/04 (2

2、006.01)1/30 (2006.01)36/06 (2006.01)3/06 (2006.01)31/04 (2006.01)35/00 (2006.01)37/02 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 3 页(54) 发明名称一种新的肋脉羊肚菌 M8-13 液体发酵物在保健品及开发中的应用(57) 摘要本 发 明 涉 及 一 种 新 分 离 的 羊 肚 菌(Morchella)M8-13 及其在的应用。及品开发中CN 102174414 A权利要求书CN 102174414 A1/1 页1. 一种肋脉羊肚菌 (Morchella Costata)M8-13，其号为

3、 CGMCC3899。2. 权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 用于发酵生产肋脉羊肚菌菌丝体的用途。3. 权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在品中的用途。4. 权利要求 3 所述的用途，其中所述品用于 ：降血脂、抑氧化、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫功能、抗疲劳，以及减轻患者放化疗引起的毒副作用。5. 权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在用于治疗疾病中的用途。6. 权利要求 5 所述的用途，其中所述疾病包括 ：肿瘤、高血脂、免疫功能失调。7. 一种用权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体发酵生产真菌多糖的方法， 包括 ：(1) 发酵培养

4、权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 的孢子 ；(2) 离心沉淀步骤 (1) 的发酵液中多糖 ；(3) 提取并纯化步骤 (2) 中沉淀的多糖。8. 权利要求 7 所述的方法，其中步骤 (3) 的提纯方法为醇沉法。9. 权利要求 1 所述的肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在用于抑菌的的中的用途。10. 权利要求 9 所述的用途，其中所述细菌为金黄色葡萄球菌。2说明书CN 102174414 A1/9 页一种新的肋脉羊肚菌 M8-13 液体发酵物在发中的应用品及开技术领域0001本发明涉及一种新分离的羊肚菌 M8-13 及其在及品开发中的应用。背景技术0002羊肚菌 (Morchella

5、sp.) 是世界著名的 ( 药 ) 食用菌，在美国被称为“”，欧美一些发达认为它是营养的高级补品。在世界各地均有分布。羊肚菌子实体含有多种化学成分，据分析测定，每 100g 干品羊肚菌中含水分 12.869g，脂肪 3.829g，蛋白质22.069g，其中蛋白质含量是木耳的 2 倍，香菇的 1.5 倍(等，1997)，且极易被吸收，这一点是其他高蛋白食品难以比拟的。羊肚菌含有 10 种氨基酸，特别是所必需的氨基酸含量丰富，高出一般食用菌的 25一 40。羊肚菌中维生素和矿物质元素种类齐全，含量高，含维生素 B 及烟酸、生物素、毗哆醇、叶酸、多种氨基酸等。每 100 克羊肚菌含矿物质元素钾 2.

6、89g，磷 1.59g，分别是冬虫夏草的 7 倍和 4 倍 ：锌的含量是香菇的 4.3 倍，猴头菌的 4 倍 ；铁的含量是香菇的 31 倍，猴头菌的 12 倍(等，2002)。羊肚菌中还含有钙、镁、钠、铬等所需的元素，尤以有机锗含量高。多种矿物质的存在，使羊肚菌更显得身价不凡。国内外的研究主要集中在多糖、氨基酸和脂肪类化合物，另外关于酶、吡喃酮抗生素、无机元素、色素、醇、甾醇和皂苷类也有【1-3】。由于羊肚菌的菌丝体不但含有子实体的各种营养物质和活性成分，而且还能较好的保持子实体独特的风味，并适于工业化发酵生产，所以羊肚菌菌丝体发酵研究近年来得到了迅速的发展，开发利用菌丝体、发酵液的以也很多。

7、发酵技术具有易操作、菌丝体增殖快、生产周期短、产量大等优点，发酵菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌各种营养成分和活性成分，可明显降低成本，提高生产效率。但是，目前国内还没有成熟羊肚菌菌丝体及多糖等方面的上市。0003羊肚菌营养丰富具有较高的药用价值，开发出系列品将具有广阔的市场前景。野生羊肚菌量有限、人工栽培不、野生羊肚菌国际市场供不应求等因素，使羊肚菌价格逐年上涨( 达 2000 元/ 公斤)。因此，通过羊肚菌发酵开发在免疫机能低下、抗药性等多方面医学难题。品将为解决人类0004大型真菌多糖免疫增强机制主要是从免疫、免疫细胞和免疫各层次刺激巨噬细胞、淋巴细胞、T 淋巴细胞、自然细胞 (NK

8、细胞 )细胞、B 细胞，增加他们的层次上促进胸腺和脾数量，增强他们的活性，进而促使免疫系统发挥作用。多糖从免疫脏的生长和分化，增加他们的重量，进而促进免疫中的 T 细胞、B 细胞和巨噬细胞的数量增加。多糖从免疫细胞层次上促进 T 细胞、B 细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞细胞、自然细胞的成熟、分化和。羊肚菌科 (Morchellaceae)，不仅营养丰富，风味独特，羊肚菌还具有较高的药效，其菌体内的多糖等成分，具有较强抗肿瘤作用，调节免疫功能，抗疲劳，并能减轻患者放化疗引起的毒副作用。由此可见，羊肚菌是是一种具有开发前景的珍稀食用菌，并可出口创汇，其在、食品、健品、化妆品等领域具有较高的应用

9、价值。羊肚菌含有较高的蛋白质碳水化合物多种氨基酸多种维生素等营养成3说明书CN 102174414 A2/9 页分 ；与冬虫夏草功能相同，是一种不含任何激素无任何副作用的天然补品，常吃不但可提高免疫力，还可消除面部的色斑黄斑雀斑使皮肤变白变嫩 2。但目前，对羊肚菌有效成分的提取与纯化研究尚不够深入，关于羊肚菌对细菌等的抑制作用基本没有查到相关0005现有技术中的问题。0006羊肚菌作为一种珍稀食药用真菌，其研究仍停留在形态学和学水平，对其营养生化特征的研究很少。国内至今没有对羊肚菌多糖进行过较系统研究。近几年，国内学等 11 以者对羊肚菌多糖的研究取得了一定进展。发酵的羊肚菌菌丝体和发酵液为主

10、要原料提取羊肚菌多糖，对影响多糖提取率的几个因素分别进行了对比实验，并对等 12 从液体多糖进行了纯化及组分鉴定。发酵所得的羊肚菌发酵液中提取了 3种羊肚菌纯多糖，分析了其组分和结构。13 用蒽酮比色法进行了羊肚菌多糖含量的测定，为羊肚菌多糖的深入研究奠定了基础。0007而羊肚菌菌丝体在营养成分上与子实体相当 15。由于羊肚菌不能进行大规模的人工栽培，因此在食用羊肚菌子实体的同时，人们更侧重于羊肚菌菌丝体的发酵研究。00081958 年 J.Sguest 首次在发酵罐内培养羊肚菌菌丝球，并进行了 25000 加仑的生产试验，上世纪 60 年代以来，美、法等国开始大规模生产其菌丝体，用以制造调味

11、品，其产品深受消费者的欢迎。目前 14 国外已经能够进行 500L 以下规模的发酵生产，并出现了专门适于羊肚菌发酵的设备。我国研究虽然较为滞后，目前仍处于中小试阶段，但近年来研究等 16取得了较大的进展。人们对羊肚菌液体菌种、液体培养基进行了广泛的研究等 17(1999) 通过摇瓶正交试(1998) 探索了羊肚菌液体培养条件并筛选了培养基验研究了尖顶羊肚菌液体发酵的合适条件。而今，人们都致力于寻找羊肚菌菌丝的最优发酵条件，以求羊肚菌菌丝产量达到更高，使效益更高。发0009 在实践中已经证明，只有获得较高活力、生产性能优良的菌株，才有可能实现发酵和生产，降低生产成本。通过自然选育淘汰活力差、发酵

12、能力弱的菌株，为进一步菌株改良和发酵生产打下一个坚实的起点和基础。因此，本发明从菌种选育着手，主要对本实验室已有的 24 株羊肚菌进行产多糖和菌丝体干重的初步筛选。从菌种方面的优势作为以后大规模发酵生产的前提，旨在提高胞外多糖量的同时生物量也达到较高水平。0010 在一个实施方案中，本发明提供了一种肋脉羊肚菌 (MorchellaCostata)M8-13，其号为 CGMCC3899。0011在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌 M8-13 用于发酵生产肋脉羊肚菌菌丝体的用途。0012在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在保健品中的用途。优选地，其中

13、所述品用于 ：降血脂、抑氧化、抗辐射、抗肿瘤、增强免疫功能、抗疲劳，以及减轻患者放化疗引起的毒副作用。0013在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在用于治疗疾病中的用途。优选地，其中所述疾病包括 ：肿瘤、高血脂、免疫功能失调。0014在另一个实施方案中，本发明提供了一种用所述肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体发酵生产真菌多糖的方法，包括 ：4说明书CN 102174414 A3/9 页(1) 发酵培养所述肋脉羊肚菌 M8-13 的孢子 ；(2) 离心沉淀步骤 (1) 的发酵液中多糖 ；(3) 提取并纯化步骤 (2) 中沉淀的多糖。001500160017001

14、80019菌的优选地，其中步骤 (3) 的提纯方法为醇沉法。在另一个实施方案中，本发明提供了所述肋脉羊肚菌 M8-13 或其菌丝体在用于抑的中的用途，优选地，其中所述细菌为金黄色葡萄球菌。附图说明0020 图 1 示出了羊肚菌 M8-13 子实体 ( 左 ) 及培养的菌丝体 ( 右 )。0021 图 2 示出了羊肚菌 M8-13 固体培养物( 左) 及 M8-13 胞内物质对金黄色葡萄球菌的抑制 ( 中 )，对照菌株 ( 右 )。0022 图3 示出了M8 系列羊肚菌生物量的比较，小写字母表示5差异显著水平，大写字母表示 1差异显著水平 ；相同字母表示差异不显。0023 图 4 示出了 M8

15、系列羊肚菌第 5 天产胞外多糖的比较，小写字母表示 5差异显著水平，大写字母表示 1差异显著水平 ；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。0024 图 5 示出了 M8 和 M9 系列羊肚菌第 5 天产胞内多糖的比较，小写字母表示 5差异显著水平，大写字母表示 1差异显著水平 ；相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。具体实施方式0025本发明的菌株的筛选、鉴定、多糖的测定筛选、抗菌活性的筛选等都是在中国，青海西宁，青海大学教授的中进行的。羊肚菌是世界著名的野生食 ( 药) 用菌，肉质脆嫩鲜美、营养和药用价值极高，故在食品、化妆品等领域显示出极大的开发潜力。近年来，由于人工砍伐森

16、林、水土流失、鼠害、人类的过度活动及对利益追逐等，青藏高原羊肚菌急剧减少。0026本发明的发明人收集并分离纯化青藏高原羊肚菌属 24 株分离株纯培养物( 分别属黄羊肚菌和黑羊肚菌涵盖了 5-6 个种 )，试验菌株 ：M8 和 M9 系列菌由青海大学生物科学系微生物2008 年 5 月和 2009 年 5 月从青藏高原采羊肚菌分离得到。发明人还选用羊肚菌 51009(Morchella esculenta 51009，中国农科院 ) 菌株做对照。0027实施例 1 羊肚菌的收集0028将自青藏高原的羊肚菌表面处理干净，用 95的乙醇擦拭后，放于干净的平皿或广口瓶中，置于烘箱中 40下，待孢子大量

17、弹出后，挑取其孢子，在 PDA( 土豆 20、蔗糖 2、琼脂 1.5-2，pH 自然 ) 平板上划线。25培养一天后用显微镜观察，待观察到有单个孢子萌发后，再将萌发处的培养基切下转移于另一 PDA 平板上。保存在 PDA 斜面培养基中。0029 发明人对这些菌株进行液体培养，所有菌株都先在 PDA 固体培养基上活化，液体发酵培养基 (KH2PO4 0.1，MgSO4 0.1，蔗糖 2，蛋白胨 0.5 )，再其转到 150mL 三角瓶装的液 60mL 的液体发酵培养基中，在 25下、100r/min 的条件下进行培养。5说明书CN 102174414 A4/9 页0030 在所培养的 24 株羊

18、肚菌中，对其生物量、胞外多糖及其对应黄色葡萄球菌的抑制作用进行研究。通过对其形态学特征的分析 ( 子实体的形态特征，例如菌丝体的宽度和生长习性) 及它的 ITS 序列，鉴定菌株肋脉羊肚菌 (Morchella Costata)M8-13。对 23 株羊肚菌进行了胞内和胞外抗菌实验筛选，供试菌种为乳酸大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 ；并用蒽酮硫酸法测定了 23 株羊肚菌的菌丝体胞内多糖含量。0031 实施例 2 筛选生物量及胞外多糖产量高的菌株 ：0032 将斜面液体石蜡封存的菌种转接至 PDA 固体培养基上，25下恒温光照培养，其中 M8 系列和 M51009 培养 5 天。在 PDA

19、 培养基中进行菌种活化后，再将其转到 150mL 三角瓶装液 60mL 的液体发酵培养基中，每种菌株做 3 个平行对照，25和 100r/min 的条件下进行培养。0033(1) 胞外多糖的沉淀 ：0034分别将培养到第 3 天、第 4 天、第 5 天的羊肚菌发酵液吸出 4mL，以 3500r/min 离心15min，每个离心管吸 3mL 上清液，加入 9mL 无水乙醇，-10沉淀 24 小时。0035(2) 胞外多糖的测定 ：0036将沉淀的多糖以 3500r/min 离心 15min，弃上清，加入 3mL 蒸馏水在 60水浴中溶解，稀释 30 倍，配成多糖溶液，用蒽酮硫酸法测定多糖，取多糖

20、溶液 2mL，置于冰水浴 5min后，在冰水浴中加蒽酮显色剂 ( 蒽酮 H2SO4 1g 500mL，待蒽酮溶解后即成 )6mL，混匀，沸水浴15min，然后再次置于冰水浴中5min，室温下平衡10min，使用UV-9200 紫外可见分光光度计 ( 北京分析仪器公司 ) 在 620nm 处比色，结果如图 4 所示。葡萄糖标准曲线方：y 9.5256x-0.0027(R2 0.9993)0037表 1 菌株的胞外多糖含量0038(3) 菌丝体干重的测定 ：将发酵 8 天的发酵液以纱布过滤以获得菌丝体，用蒸馏水反复冲洗 3 次，置烘箱中0039004055下烘至恒重，称重，结果如图 3 所示。表

21、2 菌株的菌丝体干重004100426说明书CN 102174414 A5/9 页0043实施例 3 胞内多糖测定 ：称取 0.020g 左右干燥的羊肚菌菌丝体，分两次添加共 1mL 水研磨，煮沸提取0044004530min，冷却后 2500r/min 离心 20min。取上清液置于一离心管中，再向残渣中加 1mL 水，煮沸提取30min，收集上清液置于上述同一离心管中。于上清液中加入7mL 无水乙醇使多糖析出，沉淀30min 后以2500r/min 离心20min，弃去上清液，残渣再加3.5mL 乙醇搅拌后同样离心弃去上清液。用约 80热水将沉淀溶解，冷却后同上，参见图 5。2mL，蒽酮硫

22、酸法测定多糖，实施例 4 分离菌株 M8-13 菌株的纯化 ：分离菌株 M8-13 的样品来自于羊肚菌属子实体孢子分离物。是通过在筛选培00460047养基上一系列的次代培养而纯化。筛选培养基包含 0.6蛋白胨，0.1 K2HPO4，0.05 MgSO4·7H2O，和 1葡萄糖，pH 7.0。在 28下培养 3-5 天。然后将生长良好的菌落通过次代培养转接到新鲜 PDA 培养基上。从均匀生长的菌落上，用接种环挑取一环转接到液体发酵培养基 ：KH2PO4 0.1，MgSO4 0.1，蔗糖 2，蛋白胨 0.5。在 25下，以 100rmp 的转速在摇床中培养。为了，菌株被接种到 PDA

23、培养基上于 4条件下保存。实施例 5 羊肚菌 M8-13 形态学和学上的鉴定 ：00480049将羊肚菌 M8-13 的菌丝体在 PDA 培养基上持续培养 5 天，用来测量形态学特征，如菌丝宽度，孢子的形成和孢子的形状。用 CTAB 法 (vanBurik et al.，1998)从在 PDA 培养基上生长 5 天的菌丝体中提取组 DNA，利用具有正向 ITS5 引物，5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3和 ITS4 反向引物 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3PCR 以Yang.(2007) 方法扩增 ITS DNA。后通过 NCBI BLAST 数据库对 PC

24、R 产物进行序列分析。通过和其他菌株 ITS 序列的比较，结合形态学特征，根据序列相似度确定其分类地位。ITS 的 PCR 反应体系均采用以PCR 反应体系 (25L)系 ：0050005100527说明书CN 102174414 A6/9 页0053ITSPCR 扩增程序如下 ：00541) 预变性 ：94 1min00552) 变性 ：94 15s火 ：58 15s伸 ：72 1min退延00560057005830 个循环00593) 补平 ：72 5min0060PCR 结束后取 5L 扩增产物在 1琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下检测并扩增产物在琼脂糖凝胶上的条带。所用试剂均购自上海生

25、工。0061从图 1 中可见，M8-13 的菌丝体呈现典型的白色的干的羽绒状，遍及菌落各处(Fig.3A)。菌丝体由许多间隔组成 (Fig.3B).)。为了鉴定羊肚菌 8-13，它的菌丝体接种到固体培养基固体上，在 25培养 6 天满皿。0062在和18S 核糖体部分序列相关的组鉴定，提取菌株M8-13 中的组DNA，内部转作为 PCR 扩增的模板，通过 PCR 技术，扩增内部转录间隔区 1，5.8S 核糖体 RNA录间隔区 2 和 28S 核糖体 RNA部分序列。PCR 扩增出的序列信息在 NCBI 数据库中被用来做 BLAST 研究。BLAST 结果显示 M8-13 分析区段，其中 99和

26、肋脉羊肚菌相一致。结合形态学和学的分析M8-13 件定为肋脉羊肚菌，并根据菌种的规则于 2010年 6 月 13 日路甲 3 号，中国在中国微生物菌种微生物管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区大屯：100101)号 ：CGMCC3899。0063数据处理与误差分析 ：0064采用DPS 数据处理软件进行误差分析 ：对不同菌株之间显著性检验采用Duncan 新复极差多重比较法。0065实施例 6 羊肚菌 M8-13 抑菌试验 ：0066(1) 供试菌培养及：将保存的乳酸大肠杆菌 ( 青海省畜牧兽医提供 )、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌转接至牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行活化，置于 25智能光

27、照培养箱中培养 18h。然后从中挑取细菌转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37下 100r/min 培养 10h，得到各种原菌液。吸取 20L 原菌液( 分别为乳酸大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的原菌液) 与180L 羊肚菌的发酵液( 发酵液分别取培养到第3、4、8说明书CN 102174414 A7/9 页6、8 天 ) 混匀，制成供试菌液 1。用于胞外物质抗菌筛选。0067(2) 羊肚菌 M8-13 的发酵液进行筛选抗菌实验 ：0068 取 50L 供试菌液 1 涂布于牛肉膏蛋白胨培固体养基上，25培养 18h。菌落计数。每个受试样做 2 个平行实验，并做对照 (20L 的供试菌液加

28、 180L 的蒸馏水 )。0069(3) 羊肚菌菌丝体进行的抑菌试验筛选 ：0070a. 抗菌滤纸片0071取 0.010g 干燥的羊肚菌菌丝体，加 0.3mL 水研磨。将已灭菌并干燥过的圆形滤纸片 (d 9.00mm) 放入研磨好的菌丝体液体中，浸泡 30min。0072b. 抑菌圈大小的测定0073吸取 20L 供试菌液 1 均匀涂布到牛肉膏蛋白胨平板上。每个平板上贴两个抗菌滤纸片，滤纸片离平皿边缘至少 15.00mm。置于 25智能光照培养箱中培养 18h 后取出，用直尺测量抑菌圈直径。对照为 M51009。0074结果 ：0075根据多糖产量、菌丝体生物量、抑菌试验等综合，筛选出羊肚菌

29、 M8-13 菌株为最佳菌株，可用于食品及药品的开发研究。羊肚菌 M8-13 菌株的培养特征见表 3，子实体及菌丝体见图 1。抑菌试验结果见表 4，图 2。0076表 3 羊肚菌 M8-13 菌株的培养特征00770078+”表示液体发酵培养中菌丝球数目在 25 左右0079表 4 羊肚菌 M8-13 液体发酵菌丝体对金黄色葡萄球菌的抑制作用0080羊肚菌 M8-13 对金黄色葡萄球菌的抑制作用较好，对乳酸大肠杆菌和枯草芽孢杆0081菌没有明显的抑制作用 ；羊肚菌 M8-13，发酵第八天菌丝体干中可达 5.867g/L，发酵第 3 天胞外多糖可达0.299g/L，菌丝体胞内物质对金黄色葡萄球菌

30、的抑菌圈达到20 毫米。平均生长速度每天 8.0mm，菌丝体直径 6.64-11.96m，见表 5，图 3，图 4。表 5 羊肚菌 M8-13 液体发酵胞内、胞外多糖及生物量008200839说明书CN 102174414 A8/9 页00840085008656-61.0087这种菌株具有很强的参考文献 (REFERENCES)品开发潜能。1苓. 中国羊肚菌属真菌J.科学，1999，21(2) ：2同，等 . 羊肚菌多糖研究进展 J. 微生物学杂志，2005，25(4) ：89-91.0088008942-44.0090009134. 羊肚菌研究进展 J. 食用菌学报，2002，9(2) ：56-61.莉 . 羊肚菌等野生菌无机元素分析 J. 中国野生植物，1994，(2) ：5 高尚士 .珍品羊肚菌 J. 特种动植物，2000(3) ：38.6. 羊肚菌子实体部分化学成分研究 D. 吉林 ：吉林农业大学学位论文，2006.05.01.009200937. 真菌多糖的研究进展真菌多糖的结构、提纯和应用J.