基因芯片技术基础知识(概念、制备、杂交、应用及发展方向)上课讲义

1、HGP生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的 （human genome project ），最终要搞清人类全部基因组的 30 亿左右碱基对的序列。除了 人的遗传信息以外，还有其它生物尤其是模式生物（ model organism ）已经或正在被大规 模测序， 如大肠杆菌、 啤酒酵母、 秀丽隐杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计 划。但单纯知晓生物基因组序列一级结构还远远不够， 还必须了解其中基因是怎样组织起来 的，每个基因的功能是什么， 又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中 展开其表达谱的， 即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代

2、。 随着这个功能基因组学 问题的提出（后基因组时代，蛋白组学） 1 ，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具， 最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（ 2-D-gel ）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物 芯片（ Biochip ）技术 2 。一什么是基因芯片生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小（1cm 3）的有 多聚赖氨酸 包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、 硝酸纤维素膜 、 尼龙膜 等，但需经特殊处理。 作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基 （视所要固定的分子为核 酸或寡肽而定） 并与保护基建立共价连接； 作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸

3、附 带负电荷的探针分子， 通常需包被以氨基硅烷或 多聚赖氨酸 等）将生物分子探针 （寡 核苷酸 片段或基因片段）以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子（如基因）相互作用，交行 反应的固相表面， 在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射 谱征， CCD 相机或 激光共聚焦显微镜 根据其波长及波幅特征收集信号，作出比较和检测， 从而迅速得出所要的信息。 生物芯片包括基因芯片、 蛋白质芯片、 组织芯片。 而基因芯片中， 最成功的是 DNA 芯片，即将无数预先设计好的寡 核苷酸 或 cDNA 在芯片上做成点阵，与样 品中同源核酸分子杂交 3 的芯片。基因芯片的基本原理同芯片技

4、术中杂交测序（ sequencing by hybridization, SBH ）。 即任何线状的单链 DNA 或 RNA 序列均可被分解为一个序列固定、 错落而重叠的寡 核苷酸 ， 又称亚序列( subsequence )。例如可把寡 核苷酸 序列 TTAGCTCATATG 分解成 5个 8 nt 亚 序列：(1) CTCATATG(2) GCTCATAT(3) AGCTCATA(4) TAGCTCAT(5) TTAGCTCA这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠 7个碱基。亚序列中 A、 T、C、G 4个碱基自由 组合而形成的所有可能的序列共有 65536 种。假如只考虑完全互补的杂交，那么

5、48个 8 nt亚序列探针中， 仅有上述 5个能同靶 DNA 杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的 n 体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记 DNA/RNA 序列杂交， 通过对杂交荧光信号检测， 检 出所有能与靶 DNA 杂交的寡 核苷酸 ，从而推出靶 DNA 中的所有 8 nt 亚序列，最后由计算 机对大量荧光信号的谱型( pattern )数据进行分析，重构靶 DNA 的互补寡 核苷酸 序列。二芯片类型一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类 4(一)元件型微阵列芯片1. 生物电子芯片2. 凝胶元件微阵列芯片3. 药物控释芯片(二 ) 通道型微阵列芯片1. 毛细管电泳 芯片2 .

6、PCR 扩增芯片3. 集成DNA分析芯片4. 毛细管电层析芯片（三）生物传感芯片1光学纤维阵列芯片2白光干涉谱传感芯片小鼠基因表达谱芯片（MGEC）附:目前国内基因芯片常见品种.（上海博星公司）芯片品种芯片点数MGEC-20S2000MGEC-40S4000MGEC-80S8000癌症相关基因表达谱芯片 （CRGEC）分类芯片型号芯片点数肝癌相关基因表达谱芯片LiverC-16S1626LiverC-16D3252LiverC-9.5NS954LiverC-9.5ND1908肺癌相关基因表达谱芯片Lun gC-7.3S737Lun gC-7.3D1474人类基因表达谱芯片（HGEC）芯片品种芯

7、片点数HGEC-10S1024HGEC-10D2048HGEC-20S2048HGEC-20D4096HGEC-40S4096HGEC-40D8192HGEC-80S8192HGEC-80D16184三基因芯片的制备芯片种类较多，制备方法也不尽相同，常见的芯片可分为两大类：一类是原位合成；一种是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸；直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有两种途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。光蚀刻法可以合 成30nt左右，喷印法可以合成 40-50nt，光蚀刻法每步缩合率较低，一般为95%左右，合成30nt产率仅20% ;喷印法可达99%以上，合成3

8、0nt产率可达74%，从这个意义上说喷印法 特异性应比光刻法高。此外，喷印法不需特殊的合成试剂。与原位合成法比较点样法较简单，只需将预先制备好的寡 核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片 或其它材料上即可。1原位光蚀刻合成5-7寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由 Asymetrix公司开发的，采用 的技术原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成在合成循环中探针数目呈完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列， 指数增长。某一含n

9、个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4 xn个化学步骤能合成出4n个可能结构。 例如：一个完整的十 核苷酸 通过32个化学步骤， 8个小时可能合成 65,536 个探针。目前美国 Affymetrix 公司已有同时检测 6,500 个已知人类基因的 DNA 芯片，并且正在制 备含 500,000-1,000,000 个寡 核苷酸 探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研 究的经费约 100 万美元，目前产品尚未公开投放市场发挥经济效益，但已有许多公司及研究 机构与其签约购买其产品。 该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等， 而且在大规模药 物开发方面也具有诱人的前景。 Affymetrix 的

10、大部分产品将在 98 年底全面投放市场。届时， 在其产品被广泛采用的同时， 其所有的研究投入将变成巨大的利润。 其它公司产品也正在从 实验室技术研究走向开发应用。目前，用于分子诊断的 DNA 芯片不仅已可用于检测爱滋病 病毒基因还可用于囊性纤维化（ CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光 刻设备技术复杂， 只能有专业化公司生产， 加之成本高及合成效率不高的问题， 因此有待进 行以下研究：对光刻技术进行改进，提高合成效率；开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。另一方法是光导原位合成法。 具体方法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（

11、linker ），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask ）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团， 游离羟基，利用化学反应加上第一个 核苷酸 ，所加 核苷酸 种类及在芯片上的部位预先设定， 所引入的 核苷酸 带有光敏保护基团， 以便下一步合成。 然后按上述方法在其它位点加上另外 三种 核苷酸 完成第一位 核苷酸 的合成，因而 N 个核苷酸 长的芯片需要 4N 个步骤。每一个独 特序列的探针称为一个feature，这样的芯片便具有4N个feature，包含了全部长度为 N的核苷酸 序列。这种原位直接合

12、成的方法无须制备处理克隆和 PCR 产物，但是每轮反应所需 设计的 光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达10 6探针/平方厘米，即探针间隔为 5 10 g，但只能制作II型DNA芯片。见图一。ChiptliLtf"A- minkIJCi ivjI r/Jd >Ul I 曲 c：CtiupluiifRen|S?niACATC MTrAACGeCCG ATGCTAGCATTAGAGCT GCGAAATCTTTAGGGCT VTAAfreMOftAAAATTe CCCTTAGAGGAATCTCCyW/ing CiMjpliflC Rcrapmclighi ；k i

13、j vamlPb rl 皿I、13 in tikldsynl I心 i* ef6 )llUlKtClKllkN5RcpaGcdi Synthcik CyclesNuckoiide Key- AC r G T 72原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。3点样法 点样法是将合成好的探针、cNDA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以

14、是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工点样的方法将寡 核苷酸 分子点样于化学处理后的载玻片上， 经一定的化学方法处理非干燥后， 寡 核苷酸 分子 即固定于载玻片上，制备好的 DNA 芯片可置于缓冲液中保存。由于方法费时费力，不适于 大规模 DNA 芯片制作，因而实现自动化点样就显得尤为重要。有的研究者用 多聚赖氨酸 包 被固相支待物玻片， 经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分 子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法， 与其寡核苷酸微芯片相比。 DNA 芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量 化，分类PCR产物

15、。有的研究者将玻片上覆盖 20 pm厚薄层聚丙烯酰胺凝胶作为支持物， 采用机械刻写或光刻的方法在其表面划上网格，并用激光照射蒸发掉单元间隙的多余凝胶， 以实现 DNA芯片分区，单元大小为 40 >40 pm或100 X100 pm间隔分别为50 pm和100 pm。 然后将化学方法合成的寡 核苷酸探针自动化点样于各个单元内而制成 DNA 芯片，点样速度 可达 2000 单元 /秒。其装置采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置、多个打印/喷印针的打印 /喷印头；一个减震底座， 上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。 根据需要还可以有温度和湿度 控制装置、针洗涤装置。打印 /喷印针将探针从多

16、孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接 打印时针头与芯片接触， 而在喷印时针头与芯片保持一定距离。 打印法的优点是探针密度高， 通常1平方厘米可打印 2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使 用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因 此探针密度低，通常 1平方厘米只有 400点。国外有多家实验室和公司研究开发打印/喷印设备，目前有一些已经商品化。 军事医学科学院和益生堂生物企业公司目前正在联手利用打印 /喷印技术进行生物芯片的研究和开发，预计 2年内将有用于实验室研究或临床诊断的基因芯片产品问世。见图Robot pi petter4

17、电子芯片8-10电子芯片是由美国N anogen公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学 也在开发这一技术。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化，制成1mm ximm的阵列、每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时间。制备复杂、成本高是其不足。5三维芯片11-12三维芯片是由美国的 Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家机 构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。三维生物芯片实质上 是一

18、块显微镜载玻片，其上有10,000个微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶 DNA ,RNA和蛋白质的分析。先把乙知化合物加在凝胶条上，再用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。每个毛细管能把小到0.2nl的体积打到凝胶上。以上几家机构合作研究的生物芯片系统具有其它生物芯片系统不具有的几个优点。一是凝胶的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。二是可以在芯片上同时进行扩增与检则。一般情况下，必须在微量多孔板上先进行 PCR扩增，再把样品加到芯片上，因此需要进行许多额外操作。本芯 片所用凝胶体积很小。使PCR扩增体系的体积减小1,000倍（总体积约纳升级），从而节约了每个反应所用的

19、 PCR酶（约减少100倍）。三是以三维构象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然状态在凝胶条上分析，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。6流过式芯片（flow-thru chip ） 13 Cene Logic正在开发一种在芯片片基上制成格栅状微通道，Cene Logic设计及合成特定的寡核苷酸探针，结合于微通道内芯片的特定区域。从待测样品中分离 DNA或RNA并对其进行荧光标记，然后，该样品流过芯片，固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸，采用Cene Logic's信号检测系统分析结果。 流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增

20、大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化；速度快：微通道加速了杂交反应， 减少了每次检测所需时间；价格降低：由于采用了特殊的共价化学技术将寡 核苷酸吸附于微通道内， 使 每一种流过芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。四基因芯片样品制备一般说来应用 DNA芯片进行实验包括5个过程：生物学问题的提出和芯片设计；样品制备；生物杂交反应；结果探测；数据处理和建模。1 样品制备。一般所需 mRNA的量是以一张表达谱芯片需要 3用mRNA计算的不同组织抽提3 10mRNA所需组织量器官/组织*提取3用mRNA所需组织量（克）提取10 （jgmRNA 所需织量（克）总RNA得率单位:毫克RNA/克组织mRN

21、A所占百分比%成人正常组织肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常组织脑缺数据缺数据1.30 - 1.30 mg/g缺数据成人正常组织肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常组织心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60常组织成人正常组织喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理组织结肠癌0.25210.84031.70 - 1.70 mg/g0.70病理组织1=1=1 J i=r'冃癌0.431

22、71.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理组织空肠腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理组织直肠癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理组织肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理组织肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失，客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。2样本采集过程关键点.组织标本采集操作建议规程，（取标本所需关键器材和处理要求）铝箔经DEPC水浸泡过夜，78 °C烘干，高压灭菌后

23、烘干1.5 ml微离心管15 ml聚丙烯离心管市场有售RNAase-Free 的相应规格离心管标签纸记号笔样品登记表由客户指定专人填写液氮罐应常备液氮罐，并保证液氮的来源取材部位的病理切片由客户提供1-2张注:以下步骤1 - 5应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。1离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，易V除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应

24、将 周围的肿瘤组织切除干净）。2在RNase-Free 0.9 %生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。3用铝箔包裹组织，或用 5ml冻存管装载组织（但最好统一采用铝箔）。用记号笔在铝箔或 冻 存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。4填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐5保留1-2张取材部位的病理切片。五生物芯片杂交待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、 扩增及标记。 根据样品来源、 基 因含

25、量及检测方法和分析目的不同， 采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的 基因分离、 扩增及标记技术完全可以采用， 但操作繁琐且费时。 高度集成的微型样品处理系 统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。 为了获得基因 的杂交信号必须对目的基因进行标记， 目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外 转录、 PCR 、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不 同来源样品的平行分析。 用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的 荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。杂交条件的选择与研究目的有关， 多态

26、性分析或者基因测序时， 每个 核苷酸 或突变位点 都必须检测出来。 通常设计出一套四种寡聚 核苷酸 ，在靶序列上跨越每个位点， 只在中央位 点碱基有所不同， 根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度， 即可测定出该碱基的种类。这有利于增加检测如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚 核苷酸 即可。表达检测需要长的杂交时间， 更高的严谨性， 更高的样品浓度和低温度，的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测， 要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。此外， 杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、 探针 GC 含量和所带电荷、 探针与 芯片之间连接臂的长

27、度及种类、 检测基因的二级结构的影响。 有资料显示探针和芯片之间适 当长度的连接臂可使杂交效率提高 150倍 9。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。 由于探针和检测基因均带负电荷， 因此影响他们之间的杂交结合， 为此有人提出用不带电荷 的肽核酸（ PNA ）做探针 9。虽然 PNA 的制备比较复杂，但与 DNA 探针比较有许多特点， 如不需要盐离子， 因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。 由于 PNA-DNA 结合更 加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。六 基因芯片检测原理杂交信号的检测是 DNA 芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法，

28、 如荧光显微镜 、隐逝波传感器、 光散射表面共振、 电化传感器、 化学发光、 荧光各向异性等等，但并非每种方法都适用于 DNA 芯片。由于 DNA 芯片本身的结构及性 质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模 DNA 芯片由于其面积小，密度大， 点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用 光电倍增管 或冷却的电荷偶连照相机 (charged- coupled device camera ，CCD) 摄像机等弱光信号探测装置。此外，大多数DNA 芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度， 以确定是完全杂交还是不完全 杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。 杂

29、交信号探测系统主要包括杂交 信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。由于所使用的标记物不同， 因而相应的探测方法也各具特色。 大多数研究者使用荧光标 记物，也有一些研究者使用生物素标记，联合抗生物素结合物检测 DNA 化学发光。通过检 测标记信号来确定 DNA 芯片杂交谱型。1荧光标记杂交信号的检测方法使用荧光标记物的研究者最多， 因而相应的探测方法也就最多、 最成熟。 由于 荧光显微 镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物，并具有很好的空间分辨率和热分辨 率，特别是当 荧光显微镜 中使用了共焦激光扫描时， 分辨能力在实际应用中可接近由数值孔 径和光波长决定的空间分辨率，

30、而在传统的显微镜是很难做到的，这便为 DNA 芯片进一步 微型化提供了重要的检测方法的基础。大多数方法都是在人射照明式荧光显微镜 ( epifluoescence microscope )基础上发展起来的， 包括激光扫描 荧光显微镜 、激光共焦扫描显微镜、 使用了 CCD 相机的改进的 荧光显微镜 以及将 DNA 芯片直接制作在光纤维束切面上并结合 荧光显微镜 的光纤传感器微阵列。这些方法基本上都是将待杂交对象 以荧光物质标记，如 荧光素或丽丝胶( lissamine )等，杂交后经过 SSC 和 SDS 的混合溶液或 SSPE 等缓冲液 清洗。( 1)激光扫描 荧光显微镜探测装置比较典型。

31、方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台 上，并将一物镜置于其上方， 由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面， 激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5- 10 g。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后， 由冷却的 光电倍增管 探测， 经模数转换板转换为数字信号。 通过计算机控制 传动平台 XY 方向上步进平移， DNA 芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱 型，送计算机分析处理，最后形成20 口象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的 DNA 芯片及大规模 DNA 芯片杂交信号检测， 广泛应用于基因表达、 基因诊断等方

32、面研究。(2)激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜与激光扫描 荧光显微镜 结构非常相似， 但是由于采用了共焦技术因 而更具优越性。 这种方法可以在荧光标记分子与 DNA 芯片杂交的同时进行杂交信号的探测， 而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix 公司的SP AForder 等人设计的 DNA 芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA 分子溶液放在 样品地中，芯片上合成寡 核苷酸 阵列的一面向下，与 样品池 溶液直接接触，并与 DNA 样品 杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时，既有芯片上杂交的DNA 样品所发出的荧光，也有样品地中 DNA 所发出

33、的荧光，如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。而共 焦显微镜具有非常好的纵向分辨率， 可以在接受芯片表面荧光信号的同时， 避开 样品池 中荧 光信号的影响。一般采用氩离子激光器( 488nm )作为激发光源，经物镜聚焦，从芯片背 面入射， 聚集于芯片与靶分子溶液接触面。 杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集， 并经滤 波片滤波， 被冷却的 光电倍增管 在光子计数的模式下接收。 经模数转换反转换为数字信号送 微机处理， 成像分析。 在光电信增管前放置一共焦小孔， 用于阻挡大部分激发光焦平面以外 的来自 样品池 的未杂交分子荧光信号， 避免其对探测结果的影响。 激光器前也放置一个小孔 光阑以尽量缩

34、小聚焦点处光斑半径， 使之能够只照射在单个探针上。 通过计算机控制激光束 或样品池 的移动， 便可实现对芯片的二维扫描， 移动步长与芯片上寡 核苷酸 的间距匹配， 在 时间长， 比较适合研究用。 现在 Affymetrix 公司已推出商业化样机， 整套系统约 12 万美元。几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高， 扫描（ 3）采用了 CCD 相机的 荧光显微镜这种探测装置与以上的扫描方法都是基于 荧光显微镜 ，但是以 CCD 相机作为信号接收 器而不是 光电倍增管 ，因而无须扫描传动平台。 由于不是逐点激发探测， 因而激发光照射光 场为整个芯片区域，由 CC

35、D 相机获得整个 DNA 芯片的杂交谱型。这种方法一般不采用激 光器作为激发光源， 由于激光束光强的高斯分布， 会使得光场光强度分布不均， 而荧光信号 的强度与激发光的强度密切相关， 因而不利于信号采集的线性响应。 为保证激发光匀场照射， 有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波， 通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上， 照明面 积可通过更换物镜来调整； 也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源， 使用光纤维束与 透镜结合传输激发光，并与芯片表面呈 50o 角入射。由于采用了 CCD 相机，因而大大提高 了获取荧光图像的速度， 曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。 其特点是扫描时间短， 灵敏 度和分辨

36、率较低，比较适合临床诊断用 14.（4）光纤传感器有的研究者将 DNA 芯片直接做在光纤维束的切面上（远端） ，光纤维束的另一端（近 端）经特制的耦合装置耦合到 荧光显微镜 中。光纤维束由 7 根单模光纤组成。每根光纤的直 径为200呵,两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡 核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡 核苷酸 阵列。 将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交， 通 过光纤维束传导来自 荧光显微镜 的激光（ 490urn ），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维 束传导荧光信号返回到 荧光显微镜 ，由 CCD 相机接收。每根光纤单独作用互不干扰，而溶 液中的荧光信号基

37、本不会传播到光纤中， 杂交到光纤远端的靶分子可在 90的甲酸胺（ for mamide ）和 TE 缓冲液中浸泡 10秒钟去除，进而反复使用。这种方法快速、便捷，可实时 检测 DNA 微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因 而不便于制备大规模 DNA 芯片，有一定的应用局限性。2.生物素标记方法中的杂交信号探测以生物素 ( biotin )标记样品的方法由来已久， 通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物(如结合化学发光底物酶、荧光素等) ，再利用所结合大分子的特殊性质得到最 初的杂交信号， 由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多， 因而检测方法也更趋多样

38、化。 特别是如果采用 尼龙膜 作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于 DNA 芯片杂交将受到 很大的限制， 因为在 尼龙膜 上荧光标记信号信噪比较低。 因而使用 尼龙膜 作为固相支持物的 这些研究者大多是采用生物素标记的。目前应用较多的是美国 General Scanning 公司开发的基因芯片专用检测系统 (ScanArray 3 000) ，采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集， 由计算机处理荧光信号， 并对每个点的 荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了 ScanArray 5000 ，其扫描精度和功能有较大 的提高。七 结果的分析样品在被测定前，首先要经过消化，使待测组织细胞中的

39、 DNA 或 RNA 释放出来，在经 过适当的扩增后，以荧光标记物标记，放入基因芯片自动孵育装置( Fluidics Station )中， 由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件，进行杂交， 这一过程， 仅需 要数秒钟。杂交完成后，要对基因芯片进行 “读片 ”，即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜，对 基因芯片表面的每个位点进行检测。 这种显微镜， 将聚焦的平面设定为芯片的表面， 因此可 以检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记， 而待测样品中未与芯片上探针结合的荧 光标记物， 则悬浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被检测。样品与探针的错配是影 响杂交反应结果的重要因素，

40、但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错 配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。为了使结果的检验更加简便和快速， Affymetrix 的基因芯片的分析系统中采用了基因阵 列扫描仪和专用的基因芯片工作站， 对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析， 仅 需要数分钟的时间。 这样在短短的几十分钟至数小时内， 就可以完成用传统方法需要数月才 能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。八 基因芯片的应用（一）基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性， 它可以监测细胞中几个至几千 个 mRNA 拷贝的转录情况。 与用单探针分析 mRNA 的点杂交技术不

41、同， 基因芯片表达探针 阵列应用了大约 20对寡核苷酸 探针来监测每一个 mRNA 的转录情况。每对探针中，包含一 个与所要监测的 mRNA 完全吻合和一个不完全吻合的探针（图2），这两个探针的差别在于其中间位置的 核苷酸 不同。这种成对的探针可以将非特异性杂交和背景讯号减小到最低的水 平，由此我们就可以确定那些低强度的 mRNA 。目前， Affymetrix 公司已经生产出 Hugene FL 、 Mu6500 （含有小鼠 6 500个基因）、 Ye6100 （含有酵母 6 100个基因）等基因芯片 成品。1 分析基因表达时空特征。英国剑桥大学 Whitehead 研究所的 Frank C

42、.P. Holstege 等 人，应用含有酵母基因组的基因芯片， 深入研究了真核细胞基因组的调节周期。 应用基因组 水平的表达分析，监测那些表达受转录起始机制的关键成分控制的基因，发现 RNA 聚合酶 II、主要的转录因子 TFIID和SAGA染色体修饰复合物等均在基因的表达中有自己特定的作 用位点 15 。通过本试验， 研究人员揭示了： （1）基因特异性的转录因子对表达的调控作用。 （2）细胞在缺乏营养的环境中，基因不同位点的协同调节作用的全新机制。（3）信号转导通路的最终作用位点， 在最初的几步中就可以确定。 以此试验为基础， 研究人员进一步绘制 出了酵母基因组控制图， 并由此分析出了各种

43、调节因子在基因上不同的作用位点和其作用的 分子机制。美国 Stanford 大学的 V.R.Iyer 等人16，对成纤维细胞中与细胞增生和损伤修复有关的 基因进行了分析。首先，他们用成纤维细胞中的 8600个基因片断制成基因芯片的探针阵列，通过与 mRNA 反转录形成的 cDNA 的杂交反应， 可以判断出该基因的活性。 在试验中， 成纤维细胞被置于无营养的环境中， 使绝大部分基因的活性关闭， 两天后，加入10% 的血清， 24小时内，分 6个不同的时间点，观察基因的活化情况。试验结果表明，在所有被监测的基因中，约有 500个基因最为活跃，而使细胞保持不分裂状态的基因活性被抑制。其中，最早被活化

44、的是那些转录调控基因。在活化的基因中，有28 个基因共同作用，控制细胞的增殖；8个与免疫反应的激活有关； 19 个与血管重建有关；另有许多基因，与血管新生密切相关。 在肿瘤细胞中， 基因的表达与正常的细胞存在着明显的差异。 通过基因芯片绘出基因表达的 时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征。2 基因差异表达检测 17 生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题。 理解人类 基因组中 10万个不同的基因功能，监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达( diff erential gene expression ，DGE )十分重要。对差异表达的研究， 可以推断基因与基因的 相互关系，

45、细胞分化中基因 “开启”或“关闭 ”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的 内在联系。目前 DGE 研究方法主要有表达序列标签( ESTs )测序、差减克隆( subtractiv e cloning )、差异显示( differential display )、基因表达系列分析 (serial analysis of gen e expression, SAGE) 。而 cDNA 微阵列杂交技术可监测大量 mRNA 的转录，直接快速地 检测出极其微量的 mRNA ，且易于同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段 之一。 Rihn BH 等利用基因芯片检测胸膜间皮瘤与正常细胞间比较

46、了 6500 个基因，发现了 300 多个差异基因的表达。 其中几个典型基因的表达经 RT-PCR 进行定量后， 可作为胸膜间 皮瘤诊断的标记物(Markers ) 18。Sgroi19报告DNA芯片结合激光捕获显微切割技术(I aser capture microdissection )用于乳癌浸润期和转移期及正常细胞的基因表达谱 ( gene expression profiIes )差异研究，结果被 定量 PCR 和免疫组化所证实。差异表达有助于早 期发现瘤细胞 3万个基因与正常细胞的区别， 有助于了解瘤细胞的发生、 浸润、转移和药敏。 最近，美国毒物化学研究所( CIIT ) 和国家环

47、境健康科学研究所( NIEHS )正计划在一张 玻片上建立 8 700个小白鼠 cDNA 芯片，用于肝癌的研究。我国也已成功研制出能检出 41 000 种基因表达谱的芯片。美国 Stanford 大学的 David Botstein 利用 cDNA 微阵列芯片， 对乳腺癌细胞的基因表达进行了分析， 发现其基因表达水平明显低于正常细胞。 利用基因芯 片对表达进行分析，在一次试验中可以获取相当于在60 余万次传统的 Northern 杂交中所获 得的关于基因表达的信息。 通过这种实验方法， 可以建立一种全新的肿瘤分类学方法， 即依 据每个肿瘤细胞中的基因表达情况对肿瘤细胞进行分类。 基因芯片技术在

48、分析基因的表达中 具有不可比拟的优势。3 发现新基因 Moch 等利用肿瘤微阵列芯片（ 5 184 个 cDNA 片段）发现了肾细胞癌的 肿瘤标志物基因， 并于正常细胞进行比较。 在532 份标本中检测到胞浆纤维Vimentin 的表达基因，阳性率为51%61%20。追踪观察，有 Vimentin表达的患者，预后极差。人类大量 ESTs 给 cDNA 微阵列提供了丰富的资源， 数据库中 400 000个 ESTs 代表了所有人类基因， 成千上万的 ESTs 微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。 这将大大地加速人 类基因组的功能分析 21。定量检测大量基因表达水平在阐述基因功能、 探

49、索疾病原因及机理、 发现可能的诊断及治疗 靶等方面是很有价值的。如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎（RA）和炎症性肠病（IBD）的基因表达研究中，由RA或IBD组织制备探针，用 Cy3和Cy5荧光素标记，然后与靶CDNA微阵列杂交，可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF- a IL或粒细胞集落刺激因子，同时发现一些以前未发现的基因如 HME 基因和黑色素瘤生长刺激因子。 Schena 等人22报道 了 CDNA 的微阵列在人类基因表达监测、 生物学功能研究和基因发现方面的应用。 采用含 1, 046 个已知序列的 CDNA 微阵列，用高速机器人喷印在玻片上，用双色杂交法定量监测不同 基因表达， 在

50、一定的实验条件下， 不同表达模式的阵列成分通过序列分析鉴定其特征。 该方 法较以往常用的方法敏感 10倍以上，检测限度为 1:500,000（wt/wt） 总人体 mRNA 。在培养 T 细胞热休克反应的测定中，发现 17个阵列成分的荧光比较明显改变，其中1 1个受热休克处理的诱导， 6个呈现中度抑制，对相应于 17个阵列成分的 CDNA 测序发现 5个表达最高的成 分是 5种热休克蛋白， 1 7个克隆中发现 3个新序列。另外，在佛波酯诱导检测中 23，发现有 6个阵列成分信号增强超过 2倍，测序及数据库比较揭示有 5个已知的，诱导表达最高的两个 是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-启1 ,有一

51、个是未知的。 这4个新基因的表达水平均相对较 低，仅呈现 2倍的诱导。 Northern 杂交结果证实了微阵列的结果。进一步检测了人的骨髓、4种组织中检测出 1 5种热休克和脑、前列腺及心脏组织中热休克和佛波酯调节基因的表达， 佛波酯调节基因的表达，其表达水平与 Jurkat 细胞中相应成分的表达水平密切相关如在四种组织中表达水平最高的两个基因3-actin和细胞色素C氧化酶在Jurkat细胞中的表达水平也很高。 上述实验提示在缺乏任何序列信息的条件下， 微阵列可用于基因发现和基因表达检 测。目前，大量人类 ESTs 给 cDNA 微阵列提供了丰富的资源，数据库中 400,000 个 ESTs

52、 代表了所有人类基因， 成千上万的 ESTs 微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工 具。这将大大地加速人类基因组的功能分析。4 大规模 DNA 测序 人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法 的发展。芯片技术中杂交测序( sequencing by hybridization, SBH )技术及邻堆杂交( co ntiguous stacking hybridization, CSH )技术即是一种新的高效快速测序方法 24-26 。用含 65 536个8聚寡核苷酸 的微阵列，采用 SBH 技术，可测定 200 bp 长 DNA 序列，采用 67 1 08 864个13聚

53、寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡 核苷酸 数量与长度的增加而提高， 但微阵列中寡 核苷酸数量与长度的增加则提高 了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。 CSH 技术弥补了 SBH 技术存在的弊端， CSH 技 术的应用增加了微阵列中寡 核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的 DNA 测 序。计算机模拟论证了 8聚寡核苷酸微阵列与 5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于 13聚寡核苷酸 微阵列的作用，可测定数千个 核苷酸 长的 DNA 序列26 。 Dubiley 等人26将合成的 10聚寡核 苷酸固定于排列在载片表面的 0.1 >0.1 X0.

54、02mm或1 X1 X0.02mm聚丙酰胺凝胶垫上制备聚 寡核苷酸 微阵列，先用分离微阵列( fractionation chips )进行单链 DNA 分离，再用测序微 阵列(sequencing chips )分析序列，后者联合采用了10聚寡核苷酸微阵列的酶促磷酸化、DNA 杂交及与邻堆的 5聚寡核苷酸连接等技术。该方法可用于含重复序列及较长序列的 DN A 序列测定及不同基因组同源区域的序列比较。利用基因芯片测序的准确率达99% 以上。正如 NIH 首脑 Harold Varmus 在美国细胞生物学 1 998年年会上所说： “在基因芯片的帮助 下，我们将能够监测一个细胞乃至整个组织中所

55、有基因的行为。”(二) 基因型、基因突变和多态性分析在同一物种不同种群和个体之间， 有着多种不同的基因型， 而这种不同， 往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比 较，就可以得出基因与性状的关系。 但是， 由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时 决定的， 因此分析起来就十分困难， 然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题， 利用其可以同 时反应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关 系。美国 Stanford 大学的 E.A.Winzeler 等27 ，以两种不同菌株的酵母（ S96 和 YJM789 ） 作

56、为实验材料， 对控制酵母对放线菌酮的抗药性的基因进行分析。 将含有酵母 150 000 个 D NA 片断的基因芯片分别与这两株酵母活化转录的 mRNA 分子杂交， S96 几乎全部吻合， 而 YJM789与芯片上的探针组存在较大的差异，约有3000个位点没有杂交显色。由于S96对放线菌酮有抗药性而 YJM789 的抗药性则弱的多，因此可以判定控制这一抗药性的基因的所 在。而后，通过对 S96 和 YJM789 杂交后产生的抗药子代的遗传标记的分析，进一步确定， 控制该抗药性的基因位于 15号染色体，是一长约 57 000个碱基的片断。美国国家人类基因 组研究室的 J.G.Hacia 等在 F

57、odor 研究小组的协助下 28，将基因芯片应用于双色突变分析。 他们的分析对象是与人类遗传性乳腺癌和卵巢癌密切相关的BRCA1 基因的外显子 11。在扩增后，将 BRCA1 基因的外显子 11置于含有荧光素 -12-UTP 的环境中进行体外转录反应，而 后将转录产生的 mRNA 与 BRCA1 外显子 11芯片杂交， 4小时后，用藻红蛋白染色。在观察 时，用 488nm 的氩离子激光进行扫描，荧光染色位点呈现绿色，而藻红蛋白染色的位点呈 现红色。 应用双色分析， 可以更为清楚的监测未知样品与标准链之间的竞争性杂交情况，进而分析该基因中的不同突变。通过对 15名患者 BRCA1 基因的观察，有 14名患者在外显子 1 1位点存在不同的突变。Hacia等：29在1.28 cm X1.28 cm的芯片上固定了 9.66 X104个长度为20 nt的寡核苷酸探针，用于检测乳腺癌基因BRCA1的e