用实时荧光定量PCR检测石蜡标本中的麻风菌DNA以提高PB

1、用实时荧光定量PCR检测石蜡标本中的麻风菌DNA以提高PB患者的确诊水平温温 艳艳* *1 1 杨荣德杨荣德 2 2 谭福跃谭福跃2 2 邢邢 燕燕1 1 袁联朝袁联朝 1 1 李桓英李桓英1 1 1 1 首都医科大学附属北京友谊医院首都医科大学附属北京友谊医院 北京热带医学研究所北京热带医学研究所 100050100050 2 2 云南省文山州皮肤病防治所云南省文山州皮肤病防治所 6630006630001873，麻风病是由感染麻风杆菌造成的慢性传染病,挪威 A. Hansen.从病人组织中发现麻风菌1943，氨苯砜类药物用于麻风病的治疗1958，WHO 成立了麻风防治机构,全球麻风病控制工

2、作统一计划1981，WHO 推荐联合化疗方案.麻风病麻风病 麻风菌在人体感染的过程麻风菌在人体感染的过程卜亚临床感染亚临床感染无临床症状无临床症状自我痊愈自我痊愈过程MBPBLLLLBLBLB BB BBTBTTTTT 亚临床阶段亚临床阶段 中间发展过程中间发展过程 临床变化临床变化 分型分型 目前麻风已经不再是一种灾难。1985年，122个国家中520万人感染此病；1991年WHO提出：到2000年消除麻风作为一个公共卫生问题，指标为：1/10000，世界范围总数少于6000000个病例；2005年，全球麻风病人降到3000000，目前，2000000病人，这主要归功于1980年推广的MDT

3、联合化疗。存在问题存在问题 全球麻风病每年病人数徘徊不变，在过去的8年，非洲、美洲和亚洲每年超过200000病人，提示：麻风病的传播没有阻断，主要障碍是在哪里发生和如何传播的信息不清楚；不能有效的早期诊断病人。Screening T Tests sS o u r c eNo. RegisterededEffective DateEnglishChineseMicroscopyDiagnos stic Criterion for L Leprosy 2008.01-16WS 291-2008WS 291-20082008-01-162008-01-16Slit Skin Smear &

4、& Acid-fast stainingMinistry of Public Health, Beijing, BeijingHisto-pathologySkin Biopsy in Leprosy, , D.S. Ridley, , CIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandCIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandThird Edition,1990,19901990Leprosy ELISAIDRI, , Seattle, WA98104I-I-AS-0052010-12-0 06aWhole Blood (IFN-r

5、) AssayIDRI, Seattle, , W WA98104I-AS-0062006-0 01-0 05 bELISPOTT-SPOT.TB, Oxford Immunotec TH-TB-UK-V42008-04Nested-PCRThomas M.S., , J. Clin. Microbiol, 1990, 1990 Wen Yan, , Am. J. Trop. Med. Hyg., , 20132013 pp p. 1913-1917i in press2011-11-0 06Real Time PCRTruman RW, , PLoS Negl Trop Dis, 2008

6、2008 2(11):e3282(11):e3282012-10-22麻风病早期诊断的麻风病早期诊断的实验室技术平台实验室技术平台研究背景麻风病诊断：病理组织检查和抗酸染色结合临床检查；病理学检查包括病原学检查抗酸菌（ AFB）、组织中病理变化；然而常规病理学检查（HE）存在特异性、敏感性不足，特别是对查菌阴性、病理表现为非特异性改变的患者。 PCR技术用于皮损活检和组织液的检测，可检出新鲜未固定组织标本中的微量麻风菌DNA，对早期和疑难病例的诊断有潜在优势。研究背景本实验室已经建立了Nested PCR和real time PCR方法：Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian

7、-Chao, Rong De Yang，Fu Yue Tan,Ying Zhang and Li Huan-Ying. Application of RLEP Real Time PCR for detection of M.leprae DNA in Paraffin-embedded Skip Biopsy Specimens for Diagnosis of Paucibacillary leprsy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 90(3), 2014, 524529Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian-Chao, Liu Jian, Ying

8、Zhang and Li Huan-Ying. Whole-Blood Nested-PCR Amplification of M. leprae-Specific DNA for Early Diagnosis of Leprosy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 88(5), 2013, 918922 杨荣德，谭福跃，邢燕，刘健，温艳，李桓英。实时荧光定量PCR检测石蜡标本中麻风菌DNA 中国麻风皮肤病杂志 2013，29（7）目的将real time PCR方法应用于临床初步诊断PB麻风病患者的石蜡标本；为形态学和临床的麻风病诊断提供参考依据；检测早期和疑似麻风病例，提

9、高对早期麻风的诊断水平。研究对象MDT治疗前后的皮损组织石蜡包埋标本92例；BL型麻风患者石蜡标本2008年和2013年分别为7例和8例，共15例；2012年以来陆续收集70例临床诊断PB麻风病患者的石蜡包埋组织标本。DNA提取 石蜡包埋组织标本的DNA提取。 切厚度为8-10m 的石蜡组织10片，放入1.5ml 离心管中,为了防止标本之间的交叉污染，在切不同的石蜡组织时，先用1摩尔的氢氧化钠，再用75%酒精擦洗切片刀。提取DNA的过程严格按照DNeasy Blood & Tissue kit试剂盒（QIAGEN，Cat. NO.69504）操作手册进行，脱蜡选用Deparaffini

10、zation Solution 试剂盒（QIAGEN， Cat. NO.19093）。建立real time PCR 使用Taqman探针通用PCR试剂盒(ABI, P/N 4304437)。 PCR循环条件为95变性15秒，60退火/延伸60秒，共40个循环，之前包括50 2分钟和95变性10分钟。 在ABI，Prismer 7500型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems公司）上进行实时观测以及数据的采集与分析，扩增片段长度为101bp。 Real time PCR结果判定标准标准曲线及每个检测标本均做复孔；初步确定取15Ct35作为阴阳性分析结果界定值。(每个反应管内的荧

11、光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）结果 the RLEP real-time PCR 标准曲线Ten to 107 copies of the plasmid DNA were used for standard curve preparation Ct = -3.44log + 36.65; R2 = 0.9995. Amplification Curve: A: 107 copies /l plasmid; B: 106 copies /l plasmid; C: 105 copies /l plasmid; D: 104 copies /l plasmid; E: 103 copie

12、s /l plasmid; F: 102 copies /l plasmid; G: 10 copies /l plasmid.检测结果-已确诊的麻风病患者石蜡标本real time PCR检测结果-临床初步诊断PB和I型麻风病石蜡包埋组织标本讨论 本研究对70例临床初步诊断PB和未定类麻风病患者的石蜡标本采用real time PCR检测，阳性率为 71.4%（50/70），病理检测阳性率为 51.4%（36/70），两者有显著性差异，p 0.05。BT和TT患者中查菌阴性的和未定类患者real time PCR检测阳性率均达66.7%，而病理检测阳性率分别为60%、22.2%和44.4%，显然对查菌阴性患者的辅助诊断价值较高；国外报告了60%-70%的显微镜检AFB阴性的标本PCR结果阳性，本试验得到了相似的结果；Real time PCR使用RLE