含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选实验报告

1、含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选学 院 环境与资源学院专业 环境工程 年级 2009级 姓 名 秦江涛 学 号 含酚焦化废水降解酚菌的分离、纯化与筛选 摘要 经过适当采样，采用一定的技术分离、筛选出多种优良的脱酚菌，然后观察记录其平板菌落特征，并通过革兰氏染色确定菌种为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。关键词 焦化废水 降解酚菌 分离纯化筛选我国80%的焦化废水因含多环芳烃及杂环芳烃，经生物处理后，二沉池出水难以达到排放标准。这类物质对常规生物处理系统中的微生物具有生物陌生性及毒性，很少在短时间内被活性污泥中的微生物利用而进入生物循环，有时还会使处理系统出现事故，造成微生物活性降低或大量中毒死

2、亡，导致活性污泥处理系统出水水质恶化。我小组从含酚焦化废水、活性污泥中筛选酚降解菌，并对酚降解菌进行初步观察，记录菌种形态。以期将筛选菌与活性污泥混合，用于处理含酚焦化废水。1 实验材料1.1.微生物来源 试验所用菌种来源于某焦化厂废水处理系统曝气池中的活性污泥和含酚废水，装于无菌塑料瓶中，带回实验室。置于冰箱中保存备用。1.2 培养基 分离纯化用普通牛肉膏蛋白胨培养基。筛选、驯化培养基选用液体培养液，见表1。成分MgSO4·7H2OK2HPO4无菌水pH(NH4 )2SO4含量0.3g0.3g7.07.20.3g1.3试剂苯酚，草酸铵结晶紫染液，碘液，95的酒精，番红复染液，表1试

3、剂等。1.4 其他物品无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、显微镜等。2 实验方案2.1倒平板法分离纯化一般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用含不同浓度梯度的苯酚培养基倒平板。使大量菌种中的少数耐酚菌在平板的一定浓度苯酚的培养基上生成菌落，从而分离出耐酚菌种。（1）采集的泥样，用无菌移液管取10ml接入事先已灭菌且内装90ml无菌水的三角瓶中振荡20分钟，目的是打散胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中。（2）用无菌移液管分别移取一定量苯酚，与15ml牛肉膏蛋白胨培养基倒平板。制成含酚浓度为200 mg/L ，300 mg/L ，400 mg/L， 500 mg/L ，600 m

4、g/L，700 mg/L的培养基。编号为1，2，3，4，5，6号培养皿。（3）在6个培养基上分别接种等量的微生物， 涂布分离。（4）在30恒温培养箱中培养24小时。2.2 耐酚菌筛选与驯化 将分离纯化的菌株接种到以苯酚为唯一碳源的液体培养基中，筛选驯化出对含酚水适应性强的菌种。并设置对照组。(1) 制作苯酚无机培养液，见表1，苯酚终浓度25mg/L、MgSO4.7H20终浓度0.3%，KH2PO4终浓度0.3%，(NH4 )2SO4终浓度0.3%。调7.07.2。(2) 根据6个培养基中微生物生长情况，挑选有微生物生存的浓度最高的含酚培养基上的不同典型菌落接种到液体培养基上。(3) 30摇床振

5、荡培养1d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L），30振荡培养1d；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至200mg/L）30振荡培养1d，再提高到流加250mg/L苯酚无机培养液，30培养1d后从中选出对苯酚耐受力强的菌种。2.3 革兰氏染色及菌种观察 将分离出的菌种接种到固体培养基上培养24小时，观察耐酚菌的平板菌落特征。观察菌落形状，大小，颜色，光泽，透明度边缘形态等。做革兰氏染色，鉴定菌种为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。染色步骤：（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。  （2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆

6、盖约一分钟，水洗。  （3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。  （4）复染 用番红液染12分钟，水洗。  （5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。3 实验结果与讨论31分离纯化结果不同酚浓度培养基上菌落生长情况有显著差别。从 mg/L至 mg/L菌落数量依次减少。低酚浓度的培养基上菌落生长情况较好。有多种不同的典型菌落。3. 选驯化结果 取酚浓度为00 mg/L的培养基上不同典型

7、菌落的接种到以苯酚为唯一碳源的液体培养基中。培养结果，液体培养基与空白相比都浑浊状，说明有菌种生长。33镜检结果将分离出的菌种接种到固体培养基上培养24小时，耐酚菌的平板菌落特征及革兰氏染色结果如下：属性菌落特征革兰氏染色细胞特征假细胞菌属白色透明，偏端单生或偏端生鞭毛阴性杆菌芽孢杆菌属淡黄色，单生、对生和特征性的向几个平面分裂形成不规则堆圆、四联体或立方锥阴性球形动胶菌属黄色小圆点、半透明阳性短杆短杆菌属单个、成对或成短链排列，周生鞭毛阴性短杆微球菌属中间一个无色透明小点，外面有透明圆晕，较大阴性球形34实验讨论一般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用含不同浓度梯度的苯

8、酚培养基倒平板。使大量菌种中的少数耐酚菌在平板的一定浓度苯酚的培养基上生成菌落，从而分离出耐酚菌种。在分离纯化培养后，培养基中菌落生长较好。低浓度酚培养基中菌落彼此重叠，连成一片，无法观察菌落特征，因为1号培养基中苯酚浓度最低，故对其他菌抑制作用弱而使得杂菌大量生长而2号培养基的苯酚浓度依次增大，故对苯酚耐受性弱的细菌因难以适应培养基条件而死亡，因此培养基上有单个的菌落。为了鉴定并观察分离出的耐酚菌，分别将不同菌落在液体培养基中培养，该培养基以苯酚为唯一碳源进行驯化，培养基中长出细菌，说明成功分离出降解酚的细菌。镜检表明： 耐酚菌有多个菌属，革兰氏阴性、革兰氏阳性都存在，有球菌和杆菌。有了该实验的基础，可一步研究优良脱酚菌的脱酚效能受温度、DO、pH、进水氮磷负荷等因素的影响的情况。参考文献1国家环境保护总局2002中国环境状况公报R2002：3102ujang Z，Buekley CWater and Wastewater in Developing Country：P