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文档简介

1、实验十 载体构建实验目的： 能够综合运用DNA回收、酶切、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定筛选重组质粒等分子生物学技术。 设计重组载体时的注意事项设计重组载体时的注意事项 目的DNA插入克隆载体 在克隆载体的MCS中选择合适的酶切位点： 通过引物设计在目的片段两端加上酶切位点 注意在外源DNA片段的内部不会出现这些酶切位点 目的DNA插入表达载体 除上述注意事项，引物设计时还要注意读码框要和表达载体的读码框一致实验流程 第一天： 电泳PCR产物并回收 双酶切目的片段及质粒 电泳检测、回收上述两种DNA 电泳检测回收产物 连接反应（过夜） 空闲时间准备LA（含50g/ml氨苄青霉素）平板，LB培养

2、基，试管及牙签灭菌。 第二天： 下午做转化实验 第三天：保存平板，留待下周提质粒鉴定电泳鉴定或 PCR鉴定2000100020001000（加样量同（加样量同marker）目的片段目的片段乙组提乙组提pUC1820ng/l原始原始pUC18原始原始pUC18HindIII、EcoRI双酶切50 l体系 待酶切DNA：不超过2.5 g 10Y buffer: 10 l （工作液浓度为2) EcoRI: 1 l HindIII: 1l -1.5 l 加ddH2O至总体积为50 l 37孵育1小时T4 DNA 连接酶 20 l体系 pUC18 200-400ng 待插入的DNA片段 10 buffer：2 l T4 DNA 连接酶： 1.5 l 加ddH2O至总体积为20 l15孵育4-18小

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