舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化.docx

1、舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化*周升铭，董伟华，孔天翰.（广州医学院病理生理学教研室，广东广州510182）摘罢目的比较3种流速的CM-SepharoseFF阳离子交换层析注分离舟山眼镜蛇（.Najanaja蛇毒（snakevenom.SV）的柱效，为SV的分离纯化提供实验依据.方法（1）采用3种流速CM-SepharoseFF阳离子交换层析柱分离舟山眼镜蛇蛇毒；（2）反向高效液相法分析各蛆分的纯度及内标法与CTX1标准品比较指纹图谱.姑果经过阳离子交换层析.可从蛇毒中获得7个组分（组分17）.当流速为1.4ml/min和1.8ml/min时，得到的7个组分中.组分SV1和SV2.组分

2、SV3和SV4.组分SV5、SV6和SV7组分之间分离效果较差；当流速为1.6mi/min时.各组分的分离效果理想.HPLC分析显示，组分SV5、组分SV6都是箪一成分.纯度分别为95.8%、93.6%；CTX1内惊法显示.组分SV6与CTX】指纹图谱吻合.诂论CM-SepharoseFF用于蛇毒分离可获得较高纯度的单一有效成分，流速为1.6ml/min分离效果佳.美询舟山眼镜蛇；蛇毒；纯化；鉴定中图分类号R996.3文献标识码A文章号1001-5639（2011）02-0096-06doi：10.3969/j.isj*n.1001-5639.2011.02.002Flowvelocitiyo

3、ptimizationofisolationmethodsforcomponentCTX1ofNajanajaatravenom*ZHOUSheng-mingDONGWei-hua,K()NGTian-han*(DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,Guangdong,510182,China)Abstract-ObjectiveComparingthecolumnefficiencyofthreeflowvelocitiesinCM-SepharoseFFion-exchangechromatography

4、gelchromatographyonisolatingNajanajaatrasnakevenom,itisordertoresearchanddevelopnewmethodtopurificateandcharacterizateSV.Methods(l)IsolationandpurificationofvenomwasdonebysuccessivechromatographyCM-SepharoseFastFlowinthreeflowvelocities,(2)ThecharacterizationsofthisproteinwerestudiedbyHPLC.ResultsSe

5、vencomponents(SVlSV7),wereobtainedfromNajanajaatrasnakevenombyCM-SepharoseFFchromatographycolumn.Whenflowvelocitychangedfrom1.4mi/minto1.6ml/minto1.8ml/min,SVdonotbeenseparatedcompletelyatflowvelocity1.4ml/minand1.8ml/min,whilebeenseparatedcompletelyatflowvelocity1.6ml/min.HPLCanalysisindicatedSV5an

6、dSV6weresterling.Thepuritywere95.8%and93.6%.HPLCinternalstandardmethodanalysisindicatedthatSV6wasthesamewithCTX1infingerprint.ConclusionTheparametersaboutflowvelocityof1.6ml/minlineargradientweremoreoptimuminisolationandpurificationofSVinthisexperiment.Keywords:Najanajaatraisnakevenomjpurification；c

7、haracterization蛇毒是由蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质组成的混合物.具有大量的生物学活性，如神经毒、心脏毒、细胞毒、出血毒、磷脂酶A、血液和血管活性成分及多种酶类等。蛇毒中有不少成分分离纯化后已应用于临床，如安可洛、立止血、降纤酶、东菱克栓酶、薪蛇酶等，也有一些作为工具药广,基金攻目：广州市科技局资助项M（No.福科条字20056号）,通讯作:E-mail:Kongth泛应用于生理和药理研究。心脏毒素（Cardiotox-ins）是蛇毒中一类重要的活性组分，由6063个氨基酸组成，空间结构呈三指结构，因其分子中由致密的内核伸展出3个指状肽链环而得名。有报道，用热板法测定舟山眼

8、镜蛇毒Cardiotoxin-1f的镇痛作用实验发现对急性动物疼痛模型有显著镇痛作用。对蛇毒原毒的分离方法有很多研究报道，Braganca等）采用Sephadex-G50凝胶过滤、CM-cellulose层析等对眼镜蛇（Najanaja”尸。）粗毒进行洗脱，从洗脱的4个吸收峰中分离出CTXP6。杜雨苍等采用SP-SephadexC-25柱上平衡层析方法，从广东产眼镜蛇毒中纯化出细胞膜毒素D1。为了优化CTX1分离纯化流程，提高分离效率.本研究利用离子交换层析技术一步法对样品进行了分离纯化研究，通过选择不同流速，以期寻找最佳的分离参数，实现从原毒分离CTX1的最佳分离效率，并为新药开发应用提供实

9、验依据。1材料与方法1.1蛇毒实验用舟山眼镜蛇（Najanajaatra）蛇毒原毒，由广州医学院病理生理学教研室提供。1.2 主要试剂和仪器（1）试剂：CM-SepharoseFFCGEHealthcare）,色谱纯三氯乙酸（TFA）、乙腊（ACNX德国Merck公司）；Tris-HCl（北京鼎国生物科技有限公司）。（2）仪器：ShimadzuLC-10AD高效液相色谱仪.SPD-10AUV-VIS检测器、N2000色谱工作站（日本岛津公司）;Arium631超纯水系统（德国Sartorius公司）；Alpha1-4/LSC真空冷冻干燥系统（德国Christ公司）；HD-3000型电脑核酸蛋白

10、检测仪（上海嘉鹏公司）;3K30温高速离心机（美国Sigma公司）；电子分析天平（日本A&D公司）；电导率检测仪（上海精科仪器厂）；pH检测仪、层析柱05.5cmX50cm）（海华美实验仪器厂）。1.3 实验方法3.1CM-SepharoseFastFlow离子交换层析一步法分离蛇毒原毒将蛇毒原毒冻干粉用Tris-HCl（pH8.6）缓冲液配成30mg/ml,4C过夜，20000r4C低温离心30min,取上清，去除不溶物。将样品上样到Tris-HCl缓冲液平衡后的CM-SepharoseFF柱（甲5.5cmX50cm）,上样量为900mg/30ml,蛇毒原毒上样完成后先以Tris-HCl缓冲

11、液平衡，以除去未与阳高子结合的酸性和中性蛇毒蛋白。然后以00.4mol/LNaCl的Tris-HCl洗脱液进行梯度洗脱，流速为1.4,1.63.8ml/min,部分自动收集器收集洗脱液.每管10ml。核酸蛋白检测仪测定洗脱液波长280nm处的OD值，以洗脱液在280nm波长处的吸收值（A280nln）为纵坐标，洗脱时间为横坐标绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线，收集合并各洗脱峰。1.3.2SephadexG-25脱盐将各分离样品通过SephadexG-25脱盐，洗脱液为三蒸水，洗脱流速分别为1.5.10ml/min0部分自动收集器收集脱盐峰.每管6ml。核酸蛋白检测仪测定洗脱液波长280nm处的OD值

12、，以洗脱液在280nm波长处的吸收值（A280nln）为纵坐标，洗脱时间为横坐标绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线.收集合并各洗脱峰。电导率仪检测各管蛋白的电导率，以各管的电导率值为纵坐标，洗脱时间为横坐标绘制电导率峰。将电导率值500的样品收集合并后冷冻干燥，冻干蛇毒样品于一20C密封保存。1.3.3反向高效液相RP-HPLC分析检测各洗脱样品及其纯度各蛇毒纯化样品RPHPLC分析采用C18色谱柱（Shim-packPREP-ODS,4.6mmX250mm）。流动相A：0.1%三氟乙酸溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸于70%的乙腊中。色谱条件：流速0.5ml/min,上样后经60min流动相B从0%

13、到100%浓度梯度变化洗脱。检测波长：280nm.样品处理：20000r4C低温离心15min,去除不溶物，以0.22ptm微孔滤膜过滤。样品进样浓度为0.5mg/ml,每次进样最为20事，每样品连续检测6次。将纯化组分SV5、组分SV6样品按上述条件分别进样洗脱。将CTX1标准品与组分SV6等体积混合，以CTX1作为内标进样。通过比较各峰在HPLC中的保留时间确定组分与CTX1之间的关系，再根据各组分的峰面积积分计算蛇毒组分的蛋白纯度。2结果13种流速对蛇毒原毒分离的影响舟山眼镜蛇蛇原毒经CM-SepharoseFF阳离子交换凝胶柱层析可得到7个峰，分别为SV1SV7。总收集时间约32h,组

14、分SV5、组分SV6的含址较大，约占总上样量:的1/3.改变洗脱流速对洗脱结果的影响较明显，当流速为1.4.1.8ml/min时.各组分间无明显差异，各组分间的峰谷未下降，含量较高的组分SV6与组分SV5之间分离效果较差；当流速为1.6ml/min时，组分SV4与组分SV5之间出现一个小峰，且各组分间的分离效果较好.含量高的组分SV5、组分SV6分离峰形比较完整，分离效果理想，见图lo图】CM-SepharoseFF阳离子交换蹇胶柱层析图谱A：流速为1.4流速为1.6ml/min,C：流速为1.8ml/min.I.Tris-HCI平衡；II.00.4mol/LNaCITris-HCI梯度洗脱.

15、2.23种流速对纯化样品SephadexG-25脱盐影ml/min时，盐峰和样品峰没有分开，几乎完全重叠,响SephadexG-25通过不同流速脱盐，流速为1洗脱时间为158min,见图2A；流速为5ml/min时,样品峰后部分的电导率值500.脱盐效果均不理想，洗脱时间为98min,见图2B；当流速为10ml/min时，脱盐效果理想，大部分峰的电导率值500,洗脱时间为44min.见图2C.*a3Time(min)图2SephadexG-25不同流速脱盐图A,流速为1ml/miniB：流速为5ml/miniC*速为10ml/min.2.3组分SV5和短分SV6的纯度分析RP-HPLC分析图谱

16、显示，组分SV5、组分SV6均为单一成分。根据面积归一化法计算纯度，两组分纯度分别为95.8%、93.6%组分SV5的保留时间为43.5min,见图3A；组分SV6的保留时间为44.8min,见图3B0CTX1标准品的保留时间为44.8min,见图样，出峰时间完全吻合，见图3D。3C.以CTX1为内标，与组分SV6等体积混合上图3CTX1内标法RP-HPLC分析图谱(上样量20Ml,c=0.5mg/ml)A：组分SV5】3,组分SV6,C.CTX1标准品，D：CTX1惊准品与组分SV6等体枳混合.3讨论蛇毒的成分十分复杂，其中75%85%为蛋白质。舟山眼镜蛇SV中的蛋白质成分有100多种，其中

17、40%左右为细胞毒素(Cytotoxin),又称为膜毒素(Membranetoxin)或心脏毒素(Cardiotoxin),具有广泛的生物活性。舟山眼镜蛇SV中主要有毒成分为神经毒、心脏毒、细胞毒，分子量均V10kDa,主要在67kDa之间。层析技术是一种操作比较简便，设备不太复杂，样品用最可大可小，既可用于实验室的科学研究又可用于工业化生产的生化分离技术，是近年来国内外研究分离和纯化蛇毒的主要方法但在实际应用中，柱形、凝胶的种类以及流速、梯度等的选择，都直接影响到样品的分离效果。当选择一定的凝胶时，提高分离效果就要从改变流速或梯度等分离参数入手，从而找出最佳分离条件通过适当改变流速(降低梯度

18、斜率的一种手段)可以提高分离能力。本实验所选用的凝胶为CM-SepharoscFF阳离子交换凝胶.通过改变流速，可得到不同的蛇毒样品分离结果。SV经CM-SepharoseFF阳离子交换凝胶柱层析，按蛋白质的酸碱性强弱分离获得SV1SV77个较显著的蛋白峰,其中组分SV5和组分SV6的含量较大，为强碱性蛋白质，故在高离子浓度时被洗脱出层析柱。当流速为1.4J.8ml/min时，各组分间的分离效果不明显.还有大部分交叉现象。当流速为1.6ml/min时分离效果比较理想。HPLC分析显示，组分SV5、组分SV6均为单一成分。RP-HPLC根据疏水性的差异对蛋白质进行分离，其原理与疏水层析相似，但柱

19、效远高于后者，是近年发展较快的蛋白质分离新技术。CTX与NTX、PLA的疏水性有较大差异(NTXCTXPLA),在C18柱上用乙月育梯度洗脱可将它们高效分离。此外,CTX含4对二硫键，性质十分稳定，在高浓度有机溶剂中不致失活，也是采用RPHPLC纯化CTX的依据之一。RP-HPLC纯化得到的CTX经冻干去除有机溶剂后，即可用于下一步的活性研究，也省去了其他分离方法的后续透析、浓缩等步骤。蛋白质脱盐是蛋白分离纯化一个必须的过程.脱盐的效率与质量直接影响到分离纯化的效果.如蛋白质的回收率、活性等。用膜包脱盐是蛋白质脱盐的常用方法，但是脱盐的时间长、回收率低是其主要的缺点。SephadexG-25脱

20、盐是利用分子筛原理将盐分子和蛋白质分子分离的一种方法，大分子蛋白先于盐分子被洗脱而将其分开。流速是影响SephadexG-25脱盐的一个重要因素。通过本研究显示，大流速有利于提高脱盐效果，但是为了保护凝胶和稳定柱效流速不宜过大，以10ml/min为宜。KanedaN等利用反相高效液相色谱一步法从眼镜蛇毒中分离CTX；OhkuraK等(以Sephadex-G75凝胶及CM-cellulose层析从泰国眼镜蛇毒中分离获得CTX；许云禄等【购采用SP-SephadexC-25阳离子交换法及SephasilPeptideC18反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中纯化出细胞毒素;Wei-jianJiang

21、等通过SephadexG-50和CM-SepharoseFF两步法分离蛇毒。本研究采用CM-SepharoseFF-步分离纯化原毒，平衡缓冲液平衡时，能除去大部分酸性、中性未与阳离子结合的蛋白质，占总上样量的50%左右。相比两步法分离，一步分离能显著缩短分离时间，增大上样量，同时也避免了反复冻干对蛋白质活性造成的影响。因此，作者认为，利用CM-SepharoseFF阳离子交换凝胶柱层析一步法对舟山眼镜蛇蛇毒纯化进行分离时，分离最佳流速应为1.6ml/min。#文献1 龚鑫，李怀斌，熊克仁.眼镜蛇毒对大鼠样IBc-fos表达的影响J.蛇志.2007,19(2):97-99.2 崔超伟，萱伟华.孔

22、天翰.眼镜蛇毒细胞毒素CTXn的致死毒性及药物依检性研究J.蛇志.2010,22(2),85-88.3 杨嘉琳.孔天翰.急危重症眼镜蛇伤大鼠多项提血指标动态变化J.蛇志.2010,22(3):198-202.4 YangSH,ChienCM,LuMC.etal.Up-regulationofBaxandendonucleaseGtanddownmodulationofBcl2XLinvolvedincardiotoxin皿inducedapoptosisinK562cellsJ.Expmol.med,2006,38(4)：4352444.5 BragancaBM.PaterNT.Badrina

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