聚乙烯亚胺配合灭活禽流感病毒口服免疫对鸡免疫反应和生长发育的影响.docx

1、http：/DOI：10.7685/jnau.201603004南京农业大学学报2017,40(2):302-307JournalofNanjingAgriculturalUniversity杨品品，刘瑞瑞,杨倩.聚乙烯亚胺配合灭活禽流感病毒口服免疫对鸡免疫反应和生长发育的比响J.南京农业大学学报.2017,40(2)：302-307.聚乙烯亚胺配合灭活禽流感病毒口服免疫对鸡免疫反应和生长发育的影响杨晶晶，刘瑞瑞,杨倩*(南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室，江苏南京210095)摘要：目的本文旨在研究聚乙烯亚胺(PE1)配合灭活H5N1禽流感病毒曰服免疫对鸡免疫反应和生长发育的影响。

2、方法1日龄雏鸡35只，随机分成5组，每组7只。根据免疫方法分为口服生理盐水0.3mL蛆(CK)、口服灭活禽流感病毒0.25mL组(IAIV)、口服0.08g聚乙烯亚胺所合0.25mL灭活禽流感病毒组IAIV+PEI(0.08)、口服0.02g聚乙烯亚胺配合0.25mL灭活禽流感病毒组1AIV+PEI(O.O2)和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗组(诅)。分别在首次免疫后第3、5、7周通过检测口腔棉拭子、肠道和气管涮洗液中特异性IgA、血清中特异性IgG和HI抗体水平对免疫效果进行评价，然后称体质址，检测空肠和P1肠绒毛长度以对生长发育效果进行评价。结果0.02g聚乙烯亚胺配合0.25mL灭活禽流

3、感病毒门服免疫维鸡的口腔棉拭子和肠道涮洗液中特异性IgA水平显著高于单独口服灭活病毒雏鸡组"<0.05)；0.08g和0.02g聚乙烯亚胺分别配合0.25mL灭活禽流感病毒口服免疫雏鸡后第7周，血清中特异性IgG水平极显著升高(P<0.01);0.02g聚乙烯亚胺配合0.25mL灭活禽流感病毒口服免疫雏鸡后，其空肠、回肠绒毛长度比单独口服灭活病毒极显著增长(P<0.01)o结论0.02g聚乙烯亚胺配合0.25mL灭活H5N1禽流感病毒口服免疫雏鸡，不仅增强免疫反应，提高免疫力，还能促进营养物质吸收。关键词：聚乙烯亚胺;口服免疫；灭活禽流感病毒中图分类号:S852.4

4、文献标志码：A文章编号：1000-2030(2017)02-0302-06EffectoforalimmunizationwithinactivatedavianinfluenzavirusandadjuvantpolyethyleneimineontheimmuneresponseandgrowingdevelopmentinchickenYANGJingjing,LHjRuirui,YANGQian*(KeylaboratoryofAnimalPhysiologyandBiochemistry,MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUnivers

5、ity,Nanjing210095.China)Abstract:ObjectivesAnexperimentwasconductedtoinvestigatetheeffectoforalimmunizationwithH5N1inactivatedAvianinfluenzavirus(IAIV)andadjuvantpolyethyleneimine(PEI)ontheimmuneresponseandgrowingdevelopmentinchicken.MelhcxisAccordingtotheimmunemethod,35onedayoldchickenswererandomly

6、dividedinto5groups,oralimmunizationwithnormalsaline0.3mL(CK),oralimmunizationwithIAIV0.25mL(IAIV),oralimmunizationwith0.08gPEIplusIAIV0.25mLIAIV+PE!(0.08).oralimmunizationwith0.02gPEIplusIAIV0.25n)LIAIV+PEI(0.02)ysubcutaneousinjectionwithinactivatedoil-adjuvantemulsionvaccine(ill).3,5,7weeksafterthe

7、firstvaccination,antigen-specificmucosalIgAtitersinmouthswab,trachealandintestinalwash,theantigen-specificserumIgGtitersandHItitersweredetectedtoevaluatetheimmuneeftert.Weightandthelengthofintestinalvillusinjejunumandileumweredetectedtoevaluategrowingdevelopment.ResultsTheantigen-specificIgAantibody

8、titersinmouthswabandintestinalwashinducedby0.02gPEIplus0.25mLIAIVweresubstantially(P<0.05)greaterthanantigen-alonetreatment.7weeksafterthefirstvaccination,thelevelofIgGinsenirninducedbyseruminducedby0.08gPEIand0.02gPEIplus0.25rnLIAIVweremoresignificantlyincreased(/><0.01)thanantigen-alonetr

9、eatment.Thelengthofintestinalvillusinjejunumandileumof0.02gPEIgroupweremoresigniGcantly(P<0.01)increasedthanantigen-alonetreatment.ConclusionsChickenoralimmunizationwith0.02gPEIand0.25mLII5N1IAIVcouldstrengthenimmuneresponseandabsorptionofnutrients.Keywords:polyethyleneimine;oralimmunization；inac

10、tivatedAvianirifluenzavirus收稿日期：2016-03-03基金项目：国家自然科学基金项R(31172302)；国家公益性行业(农业)科研专项(201303046)作者简介:杨晶晶.硕士研究生。通信作者：物倩.教授，博导，主寒从事动物黏膜免疫研究,E-mail：zxbyqnjau.e<o高致病性禽流感（highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）以高死亡率为主要特征，给养禽业造成严重的经济损失。目前预防和控制禽流感主要依靠皮下注射禽流感全病毒灭活疫苗,但此种免疫方式不能有效刺激局部黏膜免疫的产生，而旦皮下注射疫苗还会导致动物因应激反应造

11、成的生产力下降等不良后果以及人力、物力资源的花费。禽流感病毒（Avianinfluenza疝/你，AIV）主要通过呼吸道和消化道入侵机体，黏膜免疫将更有效地阻断禽流感病毒的入侵。口服免疫法不仅方便，还能诱导局部黏膜产生免疫应答，更重要的是口服免疫可通过共同免疫网络使其他黏膜部位产生免疫应答反应。试验表明单独应用灭活禽流感病毒（inactivatedAvianinfluenzavirus,IAIV）抗原免疫不能有效应对当前流感病毒的高变异性'I。添加佐剂或免疫增强剂以提高魏膜免疫效果，可能是解决这个问题的途径之一6刃。聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）是一种阳离子聚

12、合物，可作为体外核酸转染试剂和体内DNA疫苗递送载体1国，近年来被证实可增强多种疫苗尤其是黏膜免疫疫苗的免疫效果，并能显著增强流感疫苗对抗流感病毒的能力方。研究发现PEI与抗原结合成纳米复合物，通过树突状细胞摄取并运送到淋巴结，增强免疫应答f，4-，5o本试验应用PEI配合灭活H5N1禽流感病毒口服免疫雏鸡，研究鸡局部和全身特异性免疫反应以及对生长性能的影响，为禽流感提供方便、安全有效的防控途径。1材料与方法1.1材料1日龄雏鸡购于江苏南通普民鸡场，经检测禽流感血凝抑制抗体水平为5；1AIV由青岛农业部动物检疫所提供，病毒毒株为H5N1亚型,红细胞凝集价（HA）为10,鸡胚半数致死量（ELD）

13、为IxlO717mL*；PEI购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司（相对分子质量Mn-60000byGPC,Mw-75OOOObyLS）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸡IgA购自上海基峰生物科技有限公司；HRP标记的兔抗鸡IgG购自南京钟鼎生物科技有限公司;灭活H5N1禽流感油乳佐剂疫苗由江苏省农业科学院兽医研究所提供。分别将0.8g和0.2gPEI加入0.5mL蒸偕水中，置于37X.温箱中直至溶解，再加入2.5mL灭活禽流感病毒涡旋混匀备用。1.2动物试验1日龄惟鸡35只，随机分成5组，每组7只，按表1进行分组和免疫。首次免疫后（简称:首免）每周每只鸡翅静脉采血,3000r-min-

14、1离心10min分离血清,-20Y保存。分别于首免后第3、5、7周，称体质量,然后采取口腔棉拭子，用0.2mLPBS涮洗后10000r-min-离心10min,取上清液于-20T保存。首免后第8周断头剖杀，1）取相同部位和&度的气管段和空肠段，用PBS涮洗后，取涮洗液于-20T保存;2）取相同部位的空肠段和回肠派尔氏斑，用波恩氏液固定。表1动物试验分组及免疫Table1Thegroupandimmunemethodinanimalexperiment分组Group免疫方法Immunemethod免疫剂MImmunedose免疫日龄DaysofageCK0.3mL生理盐水Normalsa

15、line0.3mL10,141A1V口服免疫0.25mLIAIV(H5NI)10,14IA1V+PEI(O.O8)Oralimmunization0.08gPEI+0.25mLIAIV10,141AIV+PEK0.02)0.02gPEI+0.25ml,IAIV10,14iH皮下注射Subcutaneousinjection0.3mL灭活H5N1鸯流感油乳佐剂疫苗Inactivatedoil-adjuvantemulsionvaccine0.3mL101.3间接ELISA法测定血清和黏膜分泌物中的禽流感特异性IgG和IgA水平用1：100稀释的IA1V抗原包被酶标板，每孔0.1mL,4T过夜;将

16、抗原甩出，用1%BSA封闭，37T作用2h；洗涤液（PBST,pH7.4）洗涤5次，符次5min；加入待检样品（口腔、血清、气管或肠道涮洗液样品），每孔0.1mL,37X.作用1h；洗涤5次，每次5min；加HRP标记羊抗鸡lgA（l：l000）或HRP标记兔抗鸡lgG（l：500）,每孔0.1mL,37幻作用1h；洗涤5次，每次5min；加底物显色液TMB显色，每孔0.1mL,37丁避光作用810min；加终止液;酶标仪读取D攸值。用PBS代替羊抗鸡IgA或兔抗鸡IgG作对照。每个样品至少重复4次。1.4血凝抑制试验（HI）测定血清中禽流感特异性HI抗体水平在96孔微在反应板（V型）的111

17、孔加入0.025mLPBS,第12孔加入0.05rnLPBS。吸取0.025mL的待检血清加入第1孔，依次倍比稀释至第10孔，然后在第111孔均加入4HA单位禽流感（H5N1）病毒抗原0.025mL（用前混匀）。在室温（25P）下作用30min。每孔加入0.025mL1%的鸡红细胞悬液，室温（25T）下作用40min后观看结果，第11孔作为4HA单位阳性对照，第12孔为PBS阴性对照孔。以完全抑制4HA单位抗原红细胞凝集的血清最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制价（HI）。1.5石蜡切片的制作和组织学观察组织块固定,梯度乙醇脱水，二甲苯透明，透蜡，包埋，制作4呻厚的石蜡切片，HE染色。用Olymp

18、usBH-2显微镜观察并拍照。利用ipwin32系统测量空肠、回肠绒毛长度。每试验组取5张切片，每张切片选取10个视野的小肠绒毛进行统计。1.6数据统计与处理试验数据用Excel2007进行初步整理，用SPSS17.0软件进行统汁分析，采用单因子方差（One-WayANOVA）进行差异显著性分析。采用邓肯氏法进行多重比较。2结果与分析2.1PEI配合IAIV口服免疫对雏鸡口腔棉拭子、肠道和气管涮洗液中特异性IgA水平的影响从图1-A中可以看出：0.08g和0.02gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雏鸡后，第3周口腔棉拭涮洗液中特异性IgA水平显著高于单独口服0.25mLIAIV（P<

19、;0.05）；第5和第7周IgA水平与单独口服0.25mLIAIV无显著差异。从图1-B中可以看出：0.02gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雏鸡，小肠涮洗液中特异性IgA水平显著高于单独口服0.25mLIAIV、口服0.08gPE1配合0.25mLIAIV和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗免疫雏鸡（尹<0.05）；单独口服0.25mLIAIV.0.08gPEI配合0.25mLIAIV口服和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗免疫雏鸡组间IgA水平无显著差异。0.08gPEI配合0.25mLIAIV口服免疫雅鸡后，气管涮洗液中特异性IgA水平比单独口服0.25mLIAIV、口服0.02gP

20、EI配合0.25mLIAIV和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗免疫雏鸡显著下降;单独口服0.25mLIAIV,0.02gPE1配合0.25mLIAIV口服和皮下注射图1PEI配合IAIV口服免疫对口腔棉拭子（A）和肠道、气管涮洗液（B）中特异性IgA水平（S/N值）的影响Fig.1TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonthelevelofantigen-specificIgA（S/N）inmouthswab（A）andintestinal,tracheal（B）wash.P<0.05,.P<0.01.Thesameasfollows.2

21、.2PEI配合IAIV口服免疫对雏鸡血清中禽流感特异性IgG和HI抗体水平的影响2.2.1血清特异性IgG水平的变化从图2-A中可以看出：0.08g和0.02gPEI分别配合0.25mLIAIV口服免疫锥鸡后，第3和第5周血清中特异性IgG水平与单独口服IA1V无显著差异;第7周血清中特异性IgG水平比单独口服0.25mLIAIV极显著升高（P<0.01）。2.2.2血凝抑制HI结果从图2-B可以看出：0.08g和0.02gPEI配合0.25mLIAIV门服免疫雏鸡后，第14周HI抗体水平逐渐降低;第5周HI抗体水平小幅上升;第7周HI抗体水平下降至0（1。&）；与单独口服0.2

22、5mLIAIV无显著差异。皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗免疫维鸡后，第2周HI抗体水平下降至2（1。%）;第27周HI抗体水平升至7（log,）o2.3PEI配合IAIV口服免疫对体质量、空肠和回肠绒毛长度的影响2.3.1体质量的变化从图3-A中可以看出：随看日龄的增加，试验鸡体质址逐渐增加。锥鸡免疫后第1、3、7周各组间体质量无显著差异;第5周，单独口服0.25mLIAIV体质ht显著高于口服0.08g和0.02gPE1配合0.25mLIAIV和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗雏鸡（P<0.05）o2.3.2空肠、回肠绒毛长度的变化从图3-B中可以看出：0.02gPEI配合0.25mLI

23、AIV门服免疫锥鸡,比单独口服0.25mLIAIV雏鸡空肠绒毛长度极显著增长（P<0.01）,Pl肠绒毛K度显著增K（/<0.05）。SW-SIH图2PEI配合IAIV口服免疫对血清中特异性lgG(S/N值)(A)和HI(B)抗体水平的影响Fig.2TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonthelevelofantigen-specificlgG(A)andHl(B)inserumCl免后时间/wTimeafterfirstimmunizationCK；1A1V；!A!V+PEI(0.08)；1AIV+PE(O.O2)；iHsn=>

24、;«u=s«.£jo-£8113Em妾w归寒Jejunum图3PEI配合1AIV口服免疫对雏鸡体质(A)和空肠、回肠(B)绒毛长度的影响Fig.3TheeffectoforalimmunizationwithIAIVandPEIonbodyweight(A),lengthsofintestinalvillusinjejunumandileum(B)IAIVIAIVIAIV+PEI(0.08)IAIV+PEI(0.02)iHAB图4PEI配合IAIV口服免疫雏鸡（7周）后空肠（A）和回肠（B）绒毛长度的变化（HE染色,xl（）0）Fig.4Thechang

25、eoforalimmunizationwithIAIVandPEIonlengthofintestinalvillusinjejunum（A）andileum（B）byHEstaining3讨论黏膜产生的主要抗体是slgAJgA分泌细胞合成IgA,在通过黏膜上皮的过程中与上皮细胞的分泌片段结合形成slgA,分泌到黏膜表面形成防御病原微生物入侵的第一道屏障口服免疫能够在消化道和呼吸道黏膜处建立保护性免疫应答，7-，91o阳商子聚合物PEI与带负电荷的抗原易形成纳米复合物，促进抗原的加.和MHCII类分子抗原递呈,刺激机体产生抗体和CD8+T细胞介导的抗原降解，增强免疫应答：2。】。本试验应用PE

26、I配合灭活禽流感病毒口服免疫鸡,不仅激活局部黏膜免疫应答，还能诱导有效的全身免疫反应，表现在鸡消化道中特异性slgA水平和血清中IgG抗体水平的显著升高。推测PEI由于静电作用可包裹灭活禽流感病毒形成复合物,促进抗原递呈细胞如树突状细胞穿过黏膜上皮摄取抗原，传递给淋巴组织'。而阳离子聚合物PEI包裹带负电荷的灭活禽流感病毒形成的复合物带正电荷，会粘附在带负电荷的消化道黏膜上皮，避免了消化液对抗原的降解，有效增强免疫应答。0.08gPE1配合1AIV免疫的效果没有0.02gPEI配合IAIV的效果好，甚至出现0.08gPEI配合1A1V免疫锥鸡后,气管涮洗液中特异性slgA的水平显著降低

27、的现象。造成这种现象的原因可能是PEI具有细胞逐性，表现在其对细胞膜有较高的亲和性,高浓度时表现出细胞毒性)。因此,在选用PEI作为黏膜免疫佐剂时，应注意PEI的用量。综上所述，PEI在低剂最(每只0.02g)使用时免疫效果更佳。本试验应用佐剂PEI配合灭活禽流感病毒口服免疫鸡后，H1抗体滴度变化不明显，可能是此次试验选用的雏鸡母源抗体较高，而具有较高母源抗体的雏鸡免疫不能显著提高HI抗体水平。肠绒毛是肠黏膜表面上皮和固有层向肠腔内的微小突起，是营养物质消化和吸收的重要功能结构。添加免疫佐剂PEI,小肠绒毛长度增加，在一定程度上可以增强营养物质的吸收，有助于机体的生长发育。机体在营养适宜的条件

28、下，生长发育状况良好，免疫系统发育完善，保证疫苗的免疫效果，提高机体免疫力。参考文献Reference:1 于康震，崔尚金,付朝阳，等.禽流感与养禽业发展和人类健康J.中国预防停医学报,2000,22(4):312-315.YuKZ,CuiSJ,FuCY,etal.AvianinfluenzaanddevelopmentofaviculturewithhumanhealthJj.ChineseJournalofPrevenliveVeterinaryMedicine,2000,22(4)：312-315(inChinesewithEnglishabstract).2 李彦伸，戴建君，庾庆华.孙

29、膜免疫佐剂的研究进展J.中国畜牧兽医,2007,34(12):86-89.LiYS,DaiJJ,YuQII.TheresearchprogressofmucosalimmuneadjuvantJ.ChinaAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2(X)7,34(12)：86-89(inChinese).3 KangHH,WangHL,YuQH,etal.Effectofintranasalimmunizationwithinactivatedavianinfluenzavirus(»nlocalandsystemicimmuneresponsesi

30、nducksJ.PoultryScience,2012,91(5):1074-1080.4FuJ,LiangJK,KangliH,etal.EffectsofdifferentCpGoligodeoxynucleotideswithinactivatedavianH5N1influenzavirusonmucosalirnmuriityofchickensJ.PoultryScience,2013,92(11)：2866-2875.5IchinoheT,AinaiA.TashiromM,etal.Polyl：polyC12Vadjuvant-combinedintranasalvaccinep

31、nHectsmiceagainnlhighlypathogenicH5N1influenzavirusvariantsJ.Vaccine,2009,27(45)：6276-6279.6IevyR.Zakay-RonesZ.Imniunizalionofchickenswithaninactivaledoil-adjuvantNewcastlediseasevirusvaccineLJ.AvianDiseases,1973,17(3):598-604.'7ZanvitP,HavlfckovfiM,TdcnerJ,etal.Immuneresponseafteradjuvantmucosa

32、limmunizationofmicewithinactivatedinfluenzavimsJj.ImmunokyIeiters,2005,97(2)：251-259.8 JanaP,SarkarK,MitraT,etal.SynthesisofacarboxymethylatedguargumgraftedpolyethyleneiminecopolymerasaneflicientgenedeliveryvehiclefJl.RscAdvances,2016,6(17):13730-13741.9 Merkel0M,BeyerleAJjbrizziD,etal.NonviralsiRNA

33、deliverytothelung：investigationofPEG-PEIpolyplexesandtheirinvivoperfonnantp：J.MolecularPharmaceutics,2009,6(4):1246-1260.10 张宏鹏.唐小川，徐世永，等.聚乙烯亚胺提升慢病毒滴度的研究J).南京农业大学学报，2016,39(3):455-459.D01：)0.7685/jnau.201507029.ZhangHP.TangXC,XuSY,etal.Studyontheimprovementofthetiterofthelentivirusbypolyclhyleniminc

34、|J.JournalofNanjing.AgriculturalUniversity,2016,39(3)：455-459(inChinesewithEnglishabstract).'llAndreaNR.Therfleetsofphysicalandchemicalmodulatingagentsontheinductionofvaccine-inducedimmunercspon心：D.Connecticut：L'niversilyofConnecticut,2008:59.、12-HuangXG,XuJQ,QiuC,etal.MuccmuIprimingwithPEI/

35、DNAcomplexandsystemicboostingwithrecombinantTianTanvacciniaslimulatcvigorousmucosalandsystemicimmuneresponses!JJ.Vaccine,2007,25(14)：2620-2629.13OrsonFM,KinseyBM,DensmoreCL,etal.Protectionagainstinfluenzainfectionbycytokine-enhancedaerosolgeneticitnmunizalionJ.JournalofGeneMedicine,2006,8(4)：488-497

36、._14WegmannF,CardanKH,HarandiAM,al.PolyethyleneimineisapotentmucosaladjuvanttorviralglycoproleinantigensJ.NatureBiotechnology.2012,30(9)：883-888.15SheppardNCtBrinckmannSA,GartlanKH,etal.PolyethyleneimineisapotentsystemicadjuvantforglycoproteinantigensfJ.InternationalImmunology,2014,26(9)：531-538.16

37、张小飞，杨倩.几种黏膜免疫佐剂对鸡小肠IgA分泌细胞的影响J.畜牧兽医学报,2007,38(1):124-126.ZhangXF,YangQ.EffectsofseveralmucosalimmuneadjuvantsonIgAsecretingcellsofchickensmallintestine_J.ActaVeterinariuetZootechnicsSinica,2007,38(1):124-126(inChinesewithEnglishabstract).17 WamburaPN,GodfreySK.ProtectiveimmuneresponseofchickenstooralvaccinationwiththermostableliveFowlpoxvirusvaccine(strainTPV-1)coatedonoiledriceJ.TropicalAnimalHealthandProduction,2010,42(3)；451-45