荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系.docx

1、第33卷第9期2011年9月中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.33,No.9Sep.2011doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2011.09.08荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系葛叶”，张兴娟I,朱庆虎2,韩秋影I,王牟平2,李伟杰2,孙建宏2,仇华吉、(I.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所善医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙辽哈尔滨150001;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司.黑龙江哈尔滨150069)摘要：为探讨荧

2、光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试脸时于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系，本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明，两种检测方法存在正相关性，最低10s个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应，最低IO,个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间，该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。关键词：猪瘟兔化弱毒疫苗；荧光定量RT-PCR;兔体定型热试验中图分类号：S852.5文献标识码：A文章编号：1008-0589(2

3、011)09-0699-05Parallelrelationshipbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbitsfortestinghogcholeralapinizedvirusvaccinesGEYe”，ZHANGXing-juan1,ZHUQing-hu2,HANQiu-ying1,WANGMu-ping2,LIWci-Jie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金项目：国家科技支撑计划(2006BAD06A03)作者简介：葛叶(1982-),女，河北秦皇岛人，硕士,LIWci-J

4、ie2,SUNJian-hong2,QIUHua-ji1收稿日期：2011-01-11基金项目：国家科技支撑计划(2006BAD06A03)作者简介：葛叶(1982-),女，河北秦皇岛人，硕士,通信作者：E-mail:qiuhuaji(I.DivisionofSwineInfectiousDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China;2.HarbinWeik

5、cBiotechnologyDevelopmentCompany,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Toevaluateaparallelrelationshipbetweenthereal-timeRT-PCRmethodandfeverreactionmethodinrabbits,wcdetected5finishedand6semi-finishedproductsofhogcholeralapinizedvirus(HCL

6、V)vaccines.Theresultsshowedthatbothmethodshadpositivecorrelation,105copiesofHCLVwereabletoinducetypicalfeverreactionand10copiesinducemoderatefeverreactioninrabbits.Only3.5hourswasneededforthereal-timeRT-PCR,indicatingthatthereal-timeRT-PCRcouldbeanalternativetotraditionalfeverreactiontestforHCLVvacc

7、inedosagedeterminationinrabbits.Keywords：hogcholeralapinizedvirus;real-timeRT-PCR;feverreactionmethodinrabbits猪瘟是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一种严重威胁养猪业的病毒性疾病，他界动物卫生组织(OIE)将其列为须呈报的动物传染病，我国也将其列为一类传染病3】。目前用于猪瘟免疫接种的疫苗主要是猪瘟兔化弱毒细胞苗(HogCorrespondingauthorcholeralapinizedvirus,HCLV),疫苗的半成品、成品的效价测定

8、需将待检样品稀释后经耳缘静脉注射试验兔，连续4d测定兔体温变化获得，该方法费时、费力、费钱鉴于荧光定量RT-PCR方法可以对兔体组织中的猪瘟病毒含最进行实时监测，具主要从事猪瘟疫苗定坟监测方法研究.有特异、敏感、快速、高通处和实时等优点网。本研究将荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验进行平行比较，通过优化方案，多次重复试验表明，荧光定量RT-PCR检测方法可以补充传统的兔体定型热试验用于疫苗生产过程中的半成品及成品疫苗的检验，可应用该方法以缩减检验周期。1材料和方法1.1疫苗和半成品HCLV株由哈尔滨维科生物技术开发公司提供；疫苗半成品为初生犊牛睾丸细胞培养上清，收获后-20-C保存备

9、用；随机抽取5批次猪瘟细胞疫苗成品和6批半成品备检。1.2主要实验材料QIAampViralRNAKit提取试剂盒购自QIAgen公司；DEPC购自Promcga公司；HotStartExTaqDNA聚合酶、ReverseTranscriptaseXL(AMV).MgCl2(25mM)、RNA酶抑制剂(HPRI)和dNTP(10mM和2.5mM)购自宝生物工程(大连)有限公司；体质最为1.5kg3.0kg的新西兰大耳白兔购自哈尔滨坤达养殖场。1.3兔体定型热反应法测定疫苗半成品及成品猪瘟兔化弱毒疫苗效价测定按规程进行，即将样品用生理盐水稀释后，每个样品接种2只试验兔，停只经耳缘静脉注射ImL,

10、接种后，上下午各测定体温1次，48h后，每隔6h测定体温1次，根据体温反应和接种结果进行综合判定。结果判定如下：定型热反应(+):潜伏期48h96h,体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过正常体温1C以上，并稽留18h36h;轻热反应(+):潜伏期48h96h,体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过正常0.5-C以上，并稽留12h36h；无反应(-):体温正常；两只家兔均呈定型热反应标记为+/廿，一只呈定型热反应，另一只呈轻热反应标记为廿/+,两只均呈轻热反应标记为+/+,一只呈轻热反应而另一只无反应标记为+/,两只均无热反应标记为/。1.4引物使用本实验室构建的位于CSFVNS5B区域的猪瘟

11、兔化弱毒特异性引物(HCLV-F/HCLV-R)和TaqMan水解探针(HCLV.JOE)同。1.5病毒RNA的提取取140jjiL样品，用QIAampViralRNAKit提取试剂盒提取病毒RNA,具体操作方法参照说明书进行。最后用60piLAVE洗脱液洗脱溶解，直接用于cDNA的合成。1.6反转录cDNA的合成取5以病毒RNA,加入到20反转录反应体系中，内含4jiL5xRTBuffer2p.LdNTPMixture(各10mM)、50pmol9-mer随机引物、10uAMV和20uHPRl,42C水浴1h,最后95C5min灭活反转录酶1.7疫苗成品与半成品检测1.7.1荧光定量RT-P

12、CR检测荧光定量RT-PCR反应总体积25gL,反应体系含10倍系列稀释的标准品和疫苗样品的cDNA2jjlL,10xHotStartExTaqBuffer2|xL,HCLV-F、HCLV-R引物各lptL(10pM).HCLV-JOE0.4|iL(1pM),dNTPs0.4p,L(10mM),HotStartExTaq0.25pL,灭菌双蒸水补齐至25jjlLo反应条件为：95*C5min；95C30s、60C45s,40个循环。每次循环的退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。1.7.2动物接种试验为确定荧光定量RT-PCR检测方法与兔体发热反应的相关性，将经荧

13、光定量RT-PCR检测后的疫苗样品以10倍系列稀释，按照ImU只的剂量经耳缘静脉接种试验兔，测定兔体发热情况，每6h记录一次兔体温变化。为进一步确定荧光定量RT-PCR检测方法与兔体定型热反应法的虽化关系，将经荧光定量:RT-PCR检测后的猪瘟兔化弱毒疫苗按照1000病毒拷贝数/叫、100病毒拷贝数/以、20病毒拷贝数仙L、4病毒拷贝数/|iL、2病毒拷贝数仙L、1病毒拷贝数/皿、0.5病毒拷贝数/piL、0.25病毒拷贝数仙L稀释后，以ImL/H的剂量:经耳缘静脉接种试验兔，每个稀释度接种3只。接种48h后停隔6h测定体温，连续测4d,记录兔体温变化情况，同时用荧光定量RT-PCR检测接种后

14、4d家兔脾脏中的总病毒RNA含最。2结果2.1定性试验随机选取猪瘟兔化弱毒疫苗样品3份，分别用兔热法和荧光定量RT-PCR测定其效价,10倍系列稀释荧光定量RT-PCR测定的疫苗样品，耳缘静脉接种家兔1mL,连续4d记录兔体温变化，结果显示，病毒含量在不低于IO?拷贝61L时均出现定型热反应(表Do表1荧光定量RT-PCR方法与兔体反应热方法试验比较Table1Comparativedetectionusingreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits疫苗编号Vaccinebatches拷贝数蚀CopieszjiL徐群度Dilutions生理盐

15、水Norma)saline1041站I0410,10*IO720090367.66x10*-H-/+nT+/+-/-20090372.86x10，+/+-H/+/+个/+J-20100043.17x10+/+/+/+/+/20091226-14.7x10*H-/+/+/+/-+/+/+20091228-13.6x0H-/44-+/+/+/+-/-20091230-29.86x10*+/+/+/+/.+/-20091230-31.27x1伊+/+/+/-A+/-20100101l.56xl07+/+/-+/+/+/+200912242.4x10*+/+/+/-注：+/+：两只试脸兔均为定型热反应

16、；+/+：只试验兔JL定型然反应，另一只呈轻热反应；+/+：两只试验兔均呈轻热反应；+/-：两只试睑兔一只呈轻热反应，另一只无反应；-/-：两只试验兔均无反应Note:-W-/+:Bothrabbitsshowedfeverreaction;-H-/+:Onerabbitshowedfeverreaction,theothershowedmoderatefeverreaction;+/+:Bothrabbitsshowedmoderatefeverreaction;+/:Onerabbitshowedmoderatethermalreaction,theotherremainednormal;

17、/:Bothrabbitsremainednormal随机选取6份HCLV半成品，包括同一批次不同收毒时间、不同批次相同收毒时间及不同批次不同收毒时间，用两种方法进行平行测定。结果显示，荧光定&RT-PCR测定的效价与兔体发热法效价测定结果为相同稀释度，20091226-1批次的疫苗半成品荧光定虽RT-PCR检测结果为4.7xIO。拷贝，该样品IO,稀释免疫家兔，1只家兔无发热反应；将样品IO?稀释时，兔体出现轻热反应，将接种10,和10稀释度样品的家兔迫杀.无菊采取脾脏，采用荧光定量RT-PCR检测，结果显示，10。稀释度的样品检测结果呈阳性，而10,稀释度样品检测结果为阴性，表明10。稀释

18、度的病毒样品在家兔脾脏发生了病毒复制，可能由于家兔的个体差异未出现预期的发热反应；而10稀释度病毒样品在部分家兔出现发热但在脾脏未发生病毒复制，提示家兔易受非特异性因素影响致使体温异常升高，这同时显示了采用家兔发热法测定疫苗效价存在的弊端。通过荧光定量RT-PCR检测与兔体发热比较表明，两者存在很好的相关性，对3个不同批次的HCLV和6个不同批次的HCLV半成品的定性试验结果显示，经过荧光定最RT-PCR检测的样品同时按照10倍系列稀释后接种家兔，使兔体发生不同程度的发热反应.随着稀释倍数增高即病毒含量降低，兔体的发热反应逐渐减弱（表1）。2.2定量试验荧光定量RT-PCR测得2010014批

19、次和2010039批次的HCLV效价分别为1.51x106和6.02x0.用生理盐水倍比稀释后分别按1mLZ只接种试验兔，观测其体温变化.4d后，无菌摘取试验兔脾脏，研磨后对兔脾脏的总病毒及病毒负链RNA进行荧光定量RT-PCR检测及热反应试验，结果显示接种1（T个病毒拷贝数可以使兔体产生定型热反应，接种10,个病毒拷贝数可以使兔体产生轻热反应（表2、表3）,表明HCLV的兔体最小感染量（RID）为IO,个病毒拷贝数需要指出的是，在发热法测定过程中，我们发现个别家兔出现异常反应，如编号2010014-21的试验兔出现类似定型热反应，2010039-17出现类似轻型热反应，但用荧光定量RT-PC

20、R检测该兔脾脏总病毒和病毒负链RNA时，结果均呈阴性（即NoCT）,表明这两只家兔脾脏内未发生病毒复制，该家兔体温上升可能是在体温测定过程中擦伤肛门导致；表2中的2010014-18号和表3的2010039-14号试验兔，并未出现预期的发热反应，在脾脏内亦无病毒复制，推测是由于兔个体对HCLV不敏感所致。表2荧光定量RT-PCR方法与兔体反应热方法定试验比较-1Table2Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfeverreactionmethodinrabbits-1初觥毒拷则wCopies/Lininocuhte试做号Rabbitnu

21、mber鬼体发魏法FeverreactionsinrabbitsRNA找TotalRNAinthespleeniofinoculatedrabbits楼种知牌辰负俄RNAt()RNAinthespleenofinoculatedrabbits20)0014-1X4.04x10s1.16x10*io52010014-2-H-4.70x10*1.22XIO32010014-3+9.31x10*8.86xg20100144W3.61x1/2.53x10*1002010014-53.06x101.45x10*2010014+2.52x10s1.32x10*2010014-72.22X1051.23x1

22、0*20201001*2.04x1/1.I6xI02010014-94.95x1伊2.74x10*2010014-10+2.05x10s1.62x10*42010014-11+2.60XI058.98x10=2010014-124.89x10s2.37x10s2010014-13+1.55x10*8.02x!0J22010014-14+7.10x10s5.68x10*2010014-155.51X1O54.41xIO52010014-16+1.75x10,4.7xlffI2010014-1747.24x1俨4.O5XIO22010014-18NoCTNoCT2010014-19.NoCTNoC

23、T0.52010014-20NoCTNoCT2010014-21-HNoCTNoCT生夏盐水G1NoCTNoCTNormalsalineC-2.NoCTNoCT表3HCLV荧光定量RT-PCR方法与兔体反应热方法试验比较-2Table3Quantitativecomparisonbetweenreal-timeRT-PCRandfisverreactionmethodinrabbits-2Wm接勘兔牌活病lyl兔编号第停邱雷.RNAMRNA依Copies/LinRabbitnumberTotalRNAinthespleen(-)RNAinthespleenofinoculateofinocul

24、atedrabbitsinoculatedrabbits2010039-1L82x渺1.15x10sI052010039-2-H-5.32xKT4.61xlO42010039-35.34x10*1.10x10*20I003MH5.29x10*4.19x10*1002010039-5H6.53x10*1.22x102010039-6+7.56xIO41.03xlO52010039-7+6.43x10*6.81xi(r202010039-8+4.59x10*2.25x10,2010039-96.50xT4.23x10*2010039-102.01x!0*6.47x1/42010039-118.32

25、xlO52.32x10*2010039-126-MxlO4LI7X1042010039-13+1.22x10*4.53x1/22010039-14.NoCTNoCT2010039-153.30x10*5.68xKF2010039-16+4.21x105I.86XI0212010039-17NoCTNoCT2010039-183.75xI059.62xI022010039-19NoCTNoCT0.52010039-20NoCTNoCT2010039-21NoCTNoCT2010039-22NoCTNoCT0.252010039-23NoCTNoCT2010039-24NoCTNoCT生夏缺C-3

26、NoCTNoCTNormalsalineC4NoCTW3讨论HCLV以其具有对不同日龄猪无残余毒力、诱导免疫反应快和可以保护猪只抵抗猪瘟强毒的攻击等优点，成为国际上公认的最安全、有效的猪瘟疫苗。多年来，在国内外广泛应用，对猪瘟的控制起到了重要的作用四。疫苗效价的高低是判定疫苗合格与否的关键指标。HCLV效价判定常用方法兔体定型热反应法（兔热法）存在的突出不足是：不能精确定量；检测结果易受兔体个体差异和环境因素影响；实验周期长（至少4d）,费时费力；需要饲养和消耗动物，成本高。因此，如何快速、准确测定疫苗效价是猪瘟疫苗生产中面临的主要技术难题之一。研究表明，采用微量细胞培养ELISAS和反向间接

27、血凝试验测定HCLV效价，可以缩短检测时间，降低生产成本，但不能对毒价进行准确定量近年来发展起来的荧光定量RT-PCR技术以其敏感、快速和特异等特点在基因表达谱分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用叫。与兔热法相比，荧光定量RT-PCR方法敏感、稳定、准确，能有效克服家兔个体反应性差异带来的误差，操作步骤简单、自动化程度高、检测速度快，整个过程仅需3.5h,齿此它不但能快速对疫苗成品进行准确定量，而且能及时监控疫苗生产中细胞产毒情况，及时淘汰不合格批次。荧光定3RT-PCR检测所需样品量和试验材料较少，大大降低了疫苗的生产成本，也大大减少了对家兔等生物资源的耗费。本研究通过将荧光定量:

28、RT-PCR检测方法与兔体发热法进行定性定量比较分析，将荧光定量RT-PCR检测的HCLV成品、半成品系列稀释后接种试验兔，兔体温变化情况显示，随着样品稀释倍数的增高，兔体的发热情况逐渐减轻，与荧光定量RT-PCR测定的结果呈正相关，即荧光定最RT-PCR测得的拷贝数在较低的稀释度时在兔体上会出现典型的定型热反应，而稀释较高的倍数会出现轻度发热乃至不发热，表明荧光定量RT-PCR检测方法与兔体发热法的结果具有明显的相关性c为证实两者的相关性，重复检测成品、半成品9批，结果一致。为进一步确定两者的最化关系，本研究采用测定了病毒拷贝数的疫苗稀释后接种试验兔，观察兔体温变化，结果显示，当1mL疫苗稀

29、释液中含有10个病毒拷贝数时兔体呈定型热反应，1mL稀释液中含有IO个病毒拷贝数时兔体呈轻热反应，为证实该结果，重复检测2批疫苗，结果一致。表明在HCLV检验中，荧光定量RT-PCR方法与兔热法存在正相关性。荧光定量RT-PCR方法检测的是病毒（包括失活的病毒）RNA含量，间接反映病毒含量，而兔体定型热试验直接检测的是活病毒含量，尽管可以通过检测病毒负链RNA.间接反映活病毒的含量，但两种检测结果可能存在一定差异。因此，荧光定量RT-PCR方法可能并不能完全替代传统的兔热法用于HCLV半成品与成品的检验，但可以作为兔热法的有益补充。参考文献：(H股震，刘景华.动物病毒学M.北京：科学出版社，】997：652-664.2王家富.张楚瑜，傅烈振.等.中国猪痕兔化弱毒NS2-3基因的序列分析J.病毒学报.2000,16(2)：150-154.蔡宝祥.家畜传染病学(M