脑钠肽重组蛋白的表达及生物学活性的研究.docx

1、脑钠肽重组蛋白的表达及生物学活性的研究何涛君I,陆学东。郭清顺2,熊君辉2,李安2,王琼'(1.广东医学院附属深圳市福田人民医院检验医学部，广东深圳518033；2.厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建厦门361005)摘要：目的比较脑钠肽(BNP)连接在不同载体中表达的BNP成熟肽蛋白和BNP前体蛋白的生物学活性差别.方法采用分子生物学技术构定至组质粗PGEX-20T-BNP”，PGEX-20T-BNPl0a,B11-BNP和Bl1-BNP皿，分别对其进行PCR、双酶切和测序鉴定，然后将已测序芟定的包含四种重组质检的工程茵，林化至大防埃希茵BL21茵中表达BNP成熟

2、既蛋白和BNP前体蛋白，并用ELISA法检洲4种蛋白的生物学活性作用.结果在大册埃希菌中表达的成熟肽安白BNP”和前体蛋白BNPm经过纯化、复性后具有生物学活桂.结论PGEX-2OT-BNP”4l达的成熟肽安白BNP3l的生物学活性最强，为下一夕单抗制备的优势蛋白.关键词：脑钠肽；成熟肽蛋白BNP32)；前体蛋白(ENP108)中图分类号:Q784；Q786文献标志码：A文章编号：1671-7414(2009)04-027-04doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2009.04.012BrainNatriureticPeptideRecombineProteinsExpr

3、essionandActivityResearchmentHETao-junLUXue-dong'GUOQing-shun2,XIONGJun-huiLiAn2,WANGQiong1(1.DepartmentofClinicallaboratoryytheAffiliatedShenzhenFutianHospitaloftheMedicalCollegeofGuangdongGuangdongShenzhen518033;2.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDiseasesofXiamenU

4、niversity,FujianXiamen361005Abstract：ObjectiveThedifferencebetweenthebiologicalactivityofBNPmaturepolypeptidesanditsprecursorswasexaminedinthispaper.MethodsRecombinantplasmidPGEX-ZOT-BNPj：.PGEX-20T-BNP10«.Bll-BNPJtandBll-BNPigwereconstructedbymolecularbiologicalmethods,whichwereidentifiedbyPCR.

5、restrictionenzymedigestionandsequenceanalysis.Thosefourrecombinantplasmids*identifiedbysequencing,weretransformedintoE.coltBL21andexpressedBNPmaturepolypeptidesandtheircorrespondingprecursors,whosebiologicalactivitywasdeterminedbyE1A.ResultsBNPmaturepolypeptidesBNPi2anditsprecursorBNP10gwhichwereexp

6、ressedincolonbacilluswerereactiveafterpurificationandrenaturation.ConclusionBNPmaturepolypeptideswhichisexpressedbyPGEX-20T-BNP”ismostreactiveandwillbesuperiorforinducingBNP-mAbinnextstep.Keywords：brainnatriureticpeptide(BNP)jmaturepolypeptidesprotein(BNP3l)precursorsprotein(BNPJ0«)1988年,Sudoh和

7、他的同事首次从豪猪脑内分离出一种新的肽类物质，能引起利钠和利尿作用并将其命名为“脑利钠肽”，尽管其被称为脑利钠肽(BNP),但是其最主要的合成部位是心室肌，且以左心室合成为主，其分泌主要由左室壁张力进行调节，因此BNP反映心室功能改变更敏感、更具特异性'%它和利钠肽系统的另外两个重要成员心房利钠肽(ANP)及C型利钠肽(CNP)的共同结构特征是都有一个17个氨基酸组成的环状结构，脑钠肽(BNP)是继ANP后利钠肽系统的又一成员。它们都参与心血管系统的病理生理过程，在调节血压、体液平衡及心血管功能方面起重要作用。脑钠肽(BNP)是一个有32个氨基酸的多肽化合物，主要由心室分泌其BNP含量

8、且与心室体积和压力超负荷呈正比，与左心功能密切相关“乳BNP的mRNA翻译出一个含134个氨基酸残基的BNP前原体(preproBNP),在N端切去26个氨基酸残基的信号肽后成为含有108个氨基酸残基的BNP前体(proBNP),无活性的proBNP主要存在于心室肌细胞中，在蛋白酶的作用下形成1分子有活性的BNP(32个氨基酸残基)和1分子无活性的含76个氨基酸残基的片段(aminoterminalproBNP,NT-proBNP)“8。本研究旨在探讨含有108个氨基酸残基的BNP前体和含有32个氨基酸残基的活性BNP表达的蛋白的生物学功能的差别。1材料与方法作者简介：何涛君(1981-),女

9、，医学硕士，主要从事分子生物学方面的研究.通讯作者：陆学东，E-mail：luxuedonR2004.作者简介：何涛君(1981-),女，医学硕士，主要从事分子生物学方面的研究.通讯作者：陆学东，E-mail：luxuedonR2004.1.1材料TaqDNA聚合酶，T4连接酶,BamHI,EcoRI限制性内切酶,DNAmarkerDL2000均购自大连TaKaRa生物工程公司；PGEX-20T载体、B11载体、BL21菌种由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心惠赠;10901-HE1AforBNP-32(Human)购自Sigma公司；蛋白分子量Marker购自凯基生物科技发展公

10、司。1.2方法1.2.1PCR特异性扩增目的BNP前体和活性BNP基因：登录GcnBank获得BNP序列，对照PGEX-20T和B11载体上的多克隆博切位点，弓I入BamHI,NdeI和EcoRI酶切位点加上保护性碱基，设计引物上游引物分别为BNP-32-P1(TTTTGGATCCCATATGCACCGAAAATGGTA),BNP-108-P2(TTTTGGATCCCATATGCACCCGCTGGGTTCT),两者共同的下游引物BNP-P3(TTTTGAATTCTTAATGGCGACG),PCR特异性扩增出目的基因。反应体系为ddl%032.7510Xbuffer51，1。mmol/LdNTP

11、s4卜1,25mmol/LMgCI24pl,UpstreamPrimer(20/xmol/L)1fil,DownstreamPrimer(20ptmol/L)1用,模板2pd,TaKaRaExTaq(5u/ptl)O.25yl,总体积50混匀后短暂离心，先94C预变性5min后，于94C30s,58C45s,72C1min,共循环30次，获得目的基因。1.2.2重组质粒构建：将扩增得到的目的基因和PGEX,B11质粒分别进行BamHI和EcoRI双酶切和连接反应,构建重组质粒。前切体系(质粒和PCR产物各10pX.BamIII和EcoRI酶各11,Kbuffer2pl,ddH2O6pd,共20

12、)37C水浴1h,65C水浴15min终止酶切反应。连接体系(ddH?O8.5pl,10XLigationBuffer2.5pl>PCRproduct6gUPGEX-ZOT/Bl12r1,T4DNALigase1>1,共20m1)16C连接过夜，65C水浴15min终止连接反应。1.2.3重组质粒双酶切、PCR及测序鉴定：分别对其进行PCR、双酶切和送往上海生工测序鉴定。PCR和双酶切反应的体系、条件如前。1.2.4重组蛋白表达SDS-PAGE鉴定:将测序鉴定的工程菌转入大肠埃希菌BL21中，在37C,IPTG浓度为1.0mmol/L,诱导3h后均表达了目的蛋白。1.2.5重组蛋白

13、存在状态分析:首先在37C条件下，将重组菌培养至A=0.6左右。用1.。mmol/L的IPTG分别在25C诱导重组菌5h,然后收集菌体超声裂菌。离心分别收集上清和沉淀行SDS-PAGE,分析目的蛋白在超声裂解的上清还是沉淀中。1. 2.6重组蛋白的纯化将包含PGEX-20T-BNP32和PGEX-20T-BNPM8载体的重组菌大量诱导表达后留取上清过带有GST标签的纯化柱，按纯化柱的操作说明纯化目的蛋白。1. 2.7重组蛋白的溶解与复性：将包含B11-BNP”和Bll-BNPg载体的重组菌大量诱导表达后收集包涵体，首先用Buffer1(20mmol/LTris-5mol/LNaCl,20mmo

14、l/LED-TA,pH=8.5)4-等体积的4ml/dlTritoninbuffcrl的溶液洗涤包涵体两遍，离心收集菌体。分别用2,4,8mol/L的尿素溶解包涵体，同时要留取标本进行SDS-PAGE,比较目的蛋白在哪个尿素梯度溶解的效果最好。然后采用尿素梯度透析法复性，使蛋白尽虽恢复其天然构象。1.2.8重组蛋白复性后的组装：因目的蛋白具有一个环状结构域，将复性后的重组蛋白进行组装成颗粒，其会具有更强的免疫活性，组装液(20mmol/LPB6.0+300mmol/LNaCl)。1. 2.9表达的4种重组蛋白的活性检测：采用ELISA法检测比较，观察哪一种蛋白的活性最强。1.3统计学分析应用S

15、PSSU.10软件进行统计学分析，计:&资料用歹士5表示，两组比较采用t检验。2结果1目的基因的扩增结果有活性的成熟肽BNP基因(包括两端的酶切位点和保护性碱基)大小约为122bp,同样计算BNP前体基因大小约为350bp,见图1。2345l.DNAMarkerDL20002,3.PCRproductofBNP324,5.PCRproductofBNP1081.DNAMarkerDL2000；2,3.PCRproductofBNP32»4,5PCRproductofBNPjog图1PCR产物琼脂粳凝胶电泳分析2.2重组质粒的双酶切及PCR鉴定结果重组质粒PGEX-20T-BN

16、P32,B11-BNP32,PGEX-20T-BNPn8和B11-BNP睥的双酶切鉴定结果均能切出目的条带，见图2。2. 3测序鉴定将4种重组质粒的测序结果与GenBank上登录的BNP序列，在NCBI上做BLAST比对，同源性100%,完全正确，无碱基突变和读码框移位。1.PGEX-2OT-BNP32digestedbyBamHI&lEcoRI；2.Bll-BNP”digestedbyBamHi&£coRI(3.PGEX-2OT-BNPio.digestedbyBamHI&EcoRI;4.Bl1-BNPjoedigestedbyBamH1&EcoRI

17、»5.DNAMarkerDL2000图2重组质粒的双酸切鉴定2.4重组蛋白表达的存在状态分析，纯化与复性将重组蛋白未诱导和诱导的同时进行SDS-PAGE,结果显示IPTG诱导后均能表达目的蛋白，存在状态分析PGEX-20T-BNP”(29.5KDa)和PGEX-20T-BNPm(37.9KDa)表达的重组蛋白存在于超声裂菌的上清中，而B11-BNP32(19.9KDa)和Bll-BNPm(28.3KDa)表达的重组蛋白存在于超声裂菌的沉淀中。将PGEX-20T-BNP32和PGEX-2OT-BNP1O8±清表达的蛋白过GST柱纯化，把B11-BNP32和B11-BNP1O8

18、以包涵体形式表达的重组蛋白先溶解在尿素中，然后在尿素梯度透析中复性，见图3。12345678910supernatantofbrokenbacteriawithPGEX-20T-BNP”1. purificationofsupernatantwithPGEX-20T-BNP,supernatantofbrokenbacteriawithPGEX-20T-BNPIM2. purificationofsupernatantwithPGEX-20T-BNP心precipitationofbrokenbacteriawithBl1-BNP3. precipitationofBl!-BNPin8MUre

19、arcnaturationofBl1-BNP4. precipitationofbrokenbacteriawithB11-BNPIMprecipitationofB11-BNPIMin8MUrea5. renaturationofB11图3重组蛋白的纯化与复性SDS-PAGE分析2.5优势重组蛋白的选择将四种纯化与复性后的重组蛋白通过人源性BNP32-ELISA试剂盒检测，结果显示四种重组蛋白都具有生物学活性，其中以PGEX-20T-BNP32表达的蛋白的活性最强，两两之间比较差异具有统计学意义(PV0.05),见图4。免疫小白鼠，准备单抗的制备。图44种重组狼白的活性检测3讨论BNP血浆浓

20、度与心功能状态密切相关,它代表了心脏标志物检测的另外一个完全崭新的方向。检测BNP能够从那些没有临床症状或临床症状轻微的左心功能不全患者中，鉴别出需要临床治疗的患者，早期干预其心力衰竭的病理生理进程。正常BNP浓度可以在很大程度上排除心功能受损。但必须注意的是，尽管BNP可以提高心衰的诊断准确性，但它不是一个独立的检查，某些心肺疾病、肾衰、肝硬化等也可使血浆BNP浓度升高。相信随着研究的深入，BNP浓度很有可能成为评估心功能的一个重要指标，成为一项简便易行的常规检查。本研究采用基因工程方法，将目的片段克隆到原核表达载体中从而获得重组蛋白。原核表达系统表达相对简单，具有产量高、易操作、稳定性好等

21、优点。另外，它也是目前人类了解最深入最全面的基因工程表达系统，现在开发出来的基因工程产品中80%90%采用的是原核表达系统,所以我们决定选用原核系统制备BNP蛋白。首先登录GenBank获得BNP基因，通过PCR技术特异性扩增目的片段BNP”BNPm°在目的基因的特异性扩增中，上游引入BsnH1和Nde1两个魏切位点，主要是为了表达载体的选择和方便酶切鉴定。然后将其分别定向克隆到PGEX-20T和B11两个载体上，在大肠埃希菌BL21中表达BNP前体蛋白(BNP)和成熟肽蛋白(BNP108)o对4种蛋白进行相应的纯化处理，再用BNP试剂盒检测4种蛋白的活性功能差异，选择优势蛋白作为抗

22、原免疫小鼠，具有很好的免疫原性和免疫反应性，可以为下一步的脑钠肽单克隆抗体的制备奠定基础。目前国内检测BNP均依赖各种国外的试剂盒，诊断标准不统一，价格昂贵，在一定程度上限制了BNP检测在临床上的广泛应用。脑钠肽单克隆抗体的制备将有助于我们开发国产的BNP检测试剂盒。总之,BNP是反映心室功能改变更敏感、更具有特异性的生化指标，它在体内参与许多疾病的病理过程，因此其对心衰的早期诊断、评估、治疗以及心脏疾病缓解过程是非常重要的参考指标，在心血管疾病方面有着广泛的应用前景E。参考文献：1 SudohT,KangwaK,MinaminoN,etal.Anatriureticpeptideinporc

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