霍乱毒素B亚基展示HIV-1 gp41 MPER表位的研究.docx

1、nor：10.3969/j.issn.1005-1678.2017.06.001霍乱毒素B亚基展示HIV-1gp41MPER表位的研究未祥'，张芝睛J邵佳二黄芳）齐家龙二高双全之，李少勇2,李少伟1.2,夏宁邵1.2,顾颖I*（1.厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研完中心，福建厦门361102；2.厦门大学公共卫生学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室，福建厦门361102）摘要目的评价霍乱毒素B亚基艘合HIV-1gf41MPER表位的免疫效果。方法利用霍乱毒素的B亚基（CTB）作为载体展示秘向于MPER的广漕中和抗体2F5和4E10的表位。表达纯化后的融合蛋白与

2、弗氏佐剂混合乳化后免疫小鼠，免疫4次后对小鼠的血清进行综合评价。ELISA法评价融合蛋白的免疫原性；检测免疫血'清中IgA类抗体分析小鼠黏膜免疫应答；对小鼠血清中的不同类型的抗体量进行分析，通过流式细胞仪检测PBMC细胞因子IFN-7和IL4用以分析小鼠免疫激活途径；病毒中和实骏检测免疫血清对病毒感染细胞的抑制能力。结果CTB作为载体蛋白具有很好的免疫原性，能修诱导免疫系统产生针对MPER表位的抗体，剌激小鼠产生黏膜免疫应答，诱导针对MPER表位的IgA抗体。同时，融合蛋白可以刺激机体的IgCl,IgG2a和IgG2b类抗体的产生和刺激小鼠体内的TH2类免疫途径。中和实褒结果显示，CT

3、BVE10免疫后的血清可以抑制NL4-3病毒对细胞的感染。结论CTB融合蛋白具有强免疫原性，可以刺激体液免疫反应，黏膜免疫反应和Th2类免疫途径，并且CTB-4E10白免疫血清能够抑制NU-3病毒感染纫胞。本研究为HIV-1gpllMPER作为候选疫苗的探索奠定基础。关键词HIV-1gp41MPER；霍乱毒素E亚基；免疫应答中图分类号R392.11文献标识码AStudyonthecholeratoxinBsubunitdisplayingHIV-1gp41membrane-proximalexternalregionepitopeWEIXiang1,ZHANGZhi-qing2,SHAOJia

4、2,HUANGFang*,QIJia-long2,GAOShuang-quan2,LIShao-yong2,LIShao-wei1,2,XIANing-shao1,2,GUYing1,2A(1.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDisease,SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China；2.StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,SchoolofP

5、ublicHealth,XiamenUniversity,Xiamen361102,China)AbstractObjectiveToevaluatetheimmuneeffectoffusionproteinofCTBandHIV-1gp4IMPERepitope.MethodsThecholeratoxinBsubunitwasusedasacarriertodisplaytheepitopesofbNAbs2F5and4EI0targetingtheMPER.ThepuriHedfusionproteinswithFreundadjuvantwereimmunizedinmiceandt

6、heimmunizedserawereanalyzedafterthefourtimesimmunization.TheimmunogenicityofthefusionproteinswasanalyzedbyELISA.AndtheIgAantibodiesweredetectedtoevaluatethemucosalimmuneresponseinmice.Th(differenttypesofantibodiesandthecytokinesINF-、andIL-4ofPBMCwereusedtoevaluatetheimmuneresponsepathway.Besides,neu

7、tralizationassaywascarriedouttodetectedtheantiviralabilityofimmunizedserum.ResultsCTBasacarrierhasgoodimmunogenicityandfusionproteinscaninducedspecificantilxxiiesagainstMPERepitopes.Inaddition,thefusionproteinsstimulatedmucosa)immunity,inducedIgA,IgGl,IgG2aandIgG2l)antibodiesandtheH12immuneresponsep

8、athwayinmice.Importantly,CTB-4EI0immuneserumhadtheneutralizingactivityagainsttheNL4-3virus.ConclusionCTBfusionproteinshadgoodimmunogenicityandcouldinducehumoralimmunity,mucosalimmunityandTh2immuneresponsepathwayinmice.Theserumfrom'heCTB-4E10immunizedmicecouldinhibitvirusinfectingcells.Thisstudyl

9、aidthefoundationfortheexplorationofHIV-1gp41MPERascandidatevaccine.KeywordsUIV-Ig>41MPER；choleratoxinBsubunit；immuneresponse资助项目：国家自然科学据金（项目号81671645）作者简介：未祥，男.硕士研究生在读.研究方向：微生物学，E-mail：1525973431匈;顾颖，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：生物化学与分子生物学/细胞生物学,E-mail：guyinge30多年来人们致力于研发能够预防HIV-1病毒感染的疫苗，但是至今没有成功。设计能诱导机体产生

10、广谱中和抗体的免疫原是疫苗研究的关键。在H1V-1病毒表面，ENV（gpl60）H聚体膜蛋白是唯一的免疫原。随着近年来研究技术的突破,如单个B细胞分选，微量中和检测等方法的应用，越来越多的广谱中和抗体被发现，目前已发现的广谱中和抗体主要集中于ENV的六个靶点：可变区VIV2区5、ENV顶部的V3区、受体结合位点（CD4结合位点）3二即120和gp41交界面0”）、gp41的尴合肽和弟近病毒膜表面的MPER区川侦。在广谱中和抗体作用的这些靶点中，MPER区位于"41的膜外区，而且靠近病毒膜。由于该区域保守性较强而且是线性表位，'富含酪敏酸,因此是H1V-1疫苗设计的理想表位。作

11、用于该位点的广谱中和抗体主要有2F5,4E10.Z13e,10E8等。这些抗体作用于该位点能够阻止病毒细胞膜上gp41的构象改变吒，阻碍病毒膜与宿主细胞膜的融合，从而阻断病毒感染宿主细胞。但MPER表位免疫原性较差并且疏水性较强”.在体外难以有效刺激机体产生免疫应答。为了克服这些缺点，本研究中利用免疫原性较强且能形成五聚体的霍乱毒素B亚基（CTB）作为载体展示MPER的2F5和4EJ0表位，进行小鼠免疫评价.探究HIV-1gp4lMPER作为候选疫苗的免疫效果，为HIV-1疫苗研究奠定基础。1材料与方法1.I主要实脸仪器及试剂2F5和4E10（苏州杰恩生物技术有限公司），弗氏佐剂（Sigma）

12、，羊抗鼠-HRP和羊抗人-HRP（Pierce公司）,Thl和Th2细胞因子检测试剂（BDphanningeMouseThlTh2Th）7phenotypingkit）,Babl/C小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），WB化学显色底物;SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate（Thenno）o主要实验仪器:酵标仪（安图生物r程股份有限公司）,FACSAria流式细胞仪（美国BD公司），细胞培养箱（Thermo电子有限公司），PCR仪（Biometra）。1.2融合蛋白的构建及表达纯化霍乱毒素B亚基（CTB）序列来源于GenbankKF664

13、567.1并在上海生工合成，来源于NL4-3病毒的2F5（ELLELDKWA）和4E10（LWNWF-DITNWL）表位序列经过PCR链接到CTB的酸基端，同时在目的表位前插入CGGGSGGGGSGGGGS链接肽，使2F5和4E10表位更具有柔韧性。构建好的序列插入到I70-T7载体上并转入ER大肠杆渴进行蛋白表达。、彳欧的浓度达到0.801）时用1mM异内硫基-B-D-硫代毗喃半乳掳小（1PTG）在25T诱学表达12h0然后7000g离心收菌体并用裂解液（5mmol/LTris-HCl（pH7.2）.】mmol/LEDTA.30mmol/LNaCIJ重悬菌体,进行超声破碎（每500inL幽液

14、破碎3分钟）。然后25OOOg离心10min留沉淀，目的蛋白以包涵体形式表达。包涌体用含有0.5%X-triton100的buffer1（2mmol/LTris-HCl.O.5mmol/LEDTA.10mMNaCl）洗三遍，然后再用bufferf洗三道（每次都要充分悬浮），25000g离心10分钟去上清，沉淀用8M的尿素重悬，之后分别用含有6,4.2,1,0M尿素的20mMTB8.0梯度透析使蛋白复性，梯度透析夏性的融合蛋白进行15%SDS-PAGE鉴定，并且进行WesternBlotting,使用的抗体分别为广谱中和抗体2F5和4EI0。1.3小鼠免疫免疫用小鼠为8周龄Babl/C雌鼠,购买

15、于上海上海斯莱克实验动物有限责任公司。免疫采用弗氏佐剂混合皮下注射，初次免疫用完全弗氏佐剂，免疫原用址为200jig,加强免疫佐剂为非完全弗氏佐剂.免疫原为lOOpig.每隔2周免疫1次.免疫4次后进行眼球采血。37弋放置30min后高心取血清.血清在56Y灭活30inin后用于后续检测。1.4酶联免疫吸附（EL1SA）鉴定蛋门的活性和抗原的免疫原性使用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀矮抗原，终浓度为1mg/mL.稀释后的抗原加入96孔板.100jjlL/孔并于37Y放置2h,之后用洗液洗一次并甩干，处理好的板加入封闭液（PBS,O.5%酪蛋白.2%明胶,0.1%防腐剂（prodin-300）200

16、孔并于37龙放置2h或者4Y过夜，然后将封闭液甩干并将板封存待用。使用20%NBS（含有20%的胎牛血清的PBS）稀释待检测的抗体或者血清,经一定的梯度稀粹后加入到已经包被抗原的96孔板中37P孵育1h.孵育好的板用洗液洗3次.充分洗去未结合的抗体,然后加入相应的标有HRP的酶标二抗并于37弋孵育45min,再育完毕后用洗液洗去未结合的购标二抗并用甩板机充分甩干，加入显色底物显色10n）in后2M硫酸终止反应，检测450nm吸光值。1.5小鼠T细胞因子分析小鼠PBMC的分离：100皿的小仗全血中加入Iml.的红细胞裂解液（I0X红细胞裂解液：8.3gNH4C1,1gKHCOj,0.037gED

17、TANa,5%»皂素,加dclH,0至100ml.pin.1-7.4）静止45min使灯细胞充分裂斜，然后300g离心5min奔上清，细胞沉淀用PBS重悬并300g离心5min弃上清，敢复上述步骤2次,最后用PBS缓冲液重悬PBMC细胞。流式细胞仪分析:PBMC细胞的染色是根据BDphanningeMouseThlTh2Thl7phenotypingkit手册进行操作,红细胞裂解后的PBMC用BDcytofixT.M缓冲液固定形态.然后用perm/washTM缓冲液进行细胞通透，最后用鸡尾酒抗体进行荧光标记并用BeckmanCyanADP流式细胞仪分析,数据的处理用Flowjo软件分

18、析。1.6中和检测使用感染性克隆质粒转染293FT细胞生产病毒,48h后收取细胞培养液上清3000rpm/min离心7min.取上清感染TZM-hl细胞进行病毒滴度的测定。经过灭活的小俄免疫血清梯度稀释后和100倍的TCID50病彪37Y孵育Ih.然后加入到含有约10'/孔TZM-bl细胞的96孔板中,37丁培养4048h后去掉孔中的细胞上清，并用含在1%甲醛和0.2%戊二醛的PBS固定液对细胞进行固定.510min后用EBS缓冲液洗去固定液（洗3遍）.然后加入显色液50心孔（配方为各20皿的200mM铁离子和亚铁离子，浓度为2M的镁离子1皿,40mg/mL的X-gal10皿.加PBS

19、定容到1mL）：37°C显色1h后川rnmunospotSeriesAnalyzer计数被病毒感染的细胞数2结果2.1免疫原设计及蛋白纯化鉴定MPER表位位于HIVgMl的近膜端，并且具有高度的保守性.其中富含胳氛酸（图IA和图1B）。很乱毒素的R亚基（CTB）在非还原性的溶液中多数以五聚体的形式存在，本研究将靶向MPER的2F5和4E10表位融合到CTB上。并旦在表位的前端加入GGGGSGG（；GSCG（；（；S链接肽，使融合的表位具有柔性和保持其口然构象.构建融合蛋白CTB-2E5和CTB4EJ0,利用CTB增强表位的免疫原性（图】C）。融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，通过

20、洗包涌体的方式进行纯化。纯化结果如图ID所示，蛋白大小在10-15kD&之间.在非还原状态下，该蛋白多数以五聚体的形式存在，目.有部分的多聚体相叫<ElJ饼辿b欢I抵州JMfORL时傩济旬14tTIM>I|.M|.*|><|MN|!iuw¥方.哩.皿H：<dN(a)|NIPIM>I|.M|.»|><|MM|I|UI?司|V|<I|(V)U4H|.M|.>|IA|MN|I|UIT3i|IIIIU.>*<|M/Ilimuui|'!>!我*Wl琳WH：4.m(H)u»K%WE(

21、v)鲤aTl牌叩孙南VHI再用相Mf网丞好讹臂七次早那.林川（列耍奶坊叫）丸翌讪特FT弗召琨奔*f/f刃1-AiH妨同所（时）所般混ViT樗£c§|IHI.>.>1111|>.ttltllUUtllt.M£jlllll|.k»|.»f»*.M|nM|i|itir.»yi.».MkH：4R(H)|MiirX|i.»«u.>A>iifiiiiiut«in.»Hudu<it«tij(IHH|.M|.»|»IUIU.K

22、|MZIIlfUUIUIMIMMUd1101*11JJSM¥“也WW刑场winifiZi浦4$rvz|ULJ|pi°UuOU0III-HJ3也徊刃ZH，想叫WW网30血"琳州酉阳tti格岫叫41出（般哪卿咐）湘混,狄即加，牌?初仔丁州ooiM眼炊叩刈WV地%m伸弟啊砌计H：4<ihW"九如早客魂W碾就冰出的督装可8湖I冲I黑浴厂“4部所网藻E而妃的W骨笑幼聊,1照郦游邸羽&O而戏？r蝴6UY谦汁卿聊刑场不彰我利茉啊山果叩的W刑毋BU:HI背邮咐好广*坷£Mm遍尊林阔¥二执皿卿黎|出w般济冲加，"5解斟址3000

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25、HJ.：)/ixii|P»yund|hwii<h|.hui*u<>.».hjj州丑-*:drf«)9l-*sq)WUV<!W(u)sWi»MV«?/U»A；W(：>>,M«yKk4lH：4dK(H)sMM«lir«i-iihy)VMlMWoi:<t-nr>iUiK-iu:)MMJU*IHIo顷H；000：0£OPcsm.NJTKlo/类别的变化.七免疫前相比.2组免疫小鼠血清中lg(；IJgG2a和心；21>都有很大程度的提高.但是免疫前后.

26、血清中的1攻；3抗体没有变化。在这些IgG类抗体的变化中.CTB4E10效果明显高FCTB-2F5免疫组(图4A)另外.通过对gG2a与IgGI的比较发现融合蚩白免疫主要刺激小鼠的TH2类免疫途径(图4B)。这一结果在小的外周血细胞(PBMC)水平上也得到了验证(图4C和4D).2纹免疫小鼠TM类细胞因f(IFNr)儿乎没有影响.但是与对照相比.'Fh2类细胞因有明显的增加图4由清抗体类别和T细眼因子检测(A)血清抗体类则检C和D)免修激活的途役分析!fA-y11.1类免帷途径;IL4H12类免疫途径Fife4l>rfr(fKinofantikidy-uMyfw*drwlTcel

27、l<*y1<>kinr*inimmunizr<lM*nim(A)Drh-tionMantilwMlyMihlypr*.(B.ClandI)AnalyMKIhrimmunrpathwayThI.inimunr|>alhway;II.-4.1112immunrpalh，a,2.5融合蛋n免疫血清对病能的抑制能力免疫血清对病毒的抑制能力是疫苗保护效果的关键指标.小IU4次免疫后的血清56,30min灭活后用于病毒的中和实.脸。使用的病毒为B亚旅的NU-3.89.6.C亚为的MJ4和D亚型的94UGI1420倍稀释度姑评价免疫血清中和效果的最低稀释倍数，小做血清稀降20倍

28、后对病推的中和结果如图5所示.CTB-2F5免疫纹的小鼠血清对所有病毒均没有中和能力.而CTBVE10免疫组有部分小鼠对B亚型的NIA-3有较弱的中和能力.对其他病毒姐没有中和能力。CTB-2F5CTB-IEI0图5清中和检测Hg.5InununiMxl*rrumnenilralizationamqit3讨论尽管HIV-IEnv包膜蚩白H有较羸的突变性JH.是也存在部分高度保守表位.如MPER表位.因此该友位是疫苗设计的理.想祀怵(H是该表位的疏水性和低免疫哽性阻砰r疫苗的发展尽管多数研究r<利用不同的万法增强该&位的免疫原性如蚩白融合表位2,类病毒颗粒位示*.磷脂膜腿示0加等.

29、但是仍未能获得广谱中和的免疫血清或舌是抗体。本研究利用-种新型的载体蛋白CTB对MPEK的2F5和4E10表位进行展示。CTB具有较高的免疫原性而且可以形成h.聚体增加MPER表位的免疫原性融合蚩白在大肠杆倘以包涵体形式发达，经纯化后在非还原性的SDS-PAGE中可以观察到G聚体的存在,并且还有部分大Fh：聚体的多聚体存在。经过WB的检测.所&达的蛋白M以和相应的抗体很好的结合.这说明这些畏位在该蜀白上有正确的构象.抗体"I以正常识别纯化的蛋门利用弗氏佐剂对小鼠进行免疫.采用初免加强的策略经过4次免疫后.血清检测结果说明该融合步白JI有强免疫原性.可以刺激小鼠的免彼系统产生应

30、答和产生MPER特异性抗体CTB是霍乱毒素的B亚基,本身不具有毒性，而且研究表明.该蚩白可以刺激黏膜鱼段反应。黏膜免疫反应对卜防止HIV的传播有很威要的作用小鼠免疫血清IgA类抗体的检测结果显示，融合蚩白免疫后所有小鼠血清中部可以检测到高滴度的IgA抗体.这说明该融合寇白可以刺激小鼠产生较好的黏膜免疫应答另外.血清检测的IgA抗体中含有MPER表位特鼻性IgA,但是不同的小鼠个体差异性较大仃效的免校"I以改变免疫细胞的微拜境.影响辅助性T细胞的分化.从而影响B细胞的分化和成熟对免疫后的血清分析发现.CTB融合策白主要剌激小融IgGIJgG2a和lgG2b类抗体的反应，而在免疫后几F未

31、产生W；3类的抗体lpG2a与lg<；l的比例结果显示CTB融合蛋白免疫后激活的主要是Th2免疫途径.该结果与在细胞水*对Thl(IEN-7)和Th2(IL4)细胞因F的分析结果-致.融合蛋白免疫没有影响TM免疫途径。在抑制病母感染方面.CTR-2F5免疫血清对4种病嵌都没有抑制能力.但是CTB4EI0免疫组有部分小M的免疫血清凹以抑制B亚型的NI4-3对细胞的感染由于目前发现的祀向MPEB的广谱中和抗体都有自身反应性('j细胞膜的反应性).推测原因可能是MPER类广谱中和抗体的产生需要细胞膜的辅助另外.广谱中和抗体的产生需要较K时间发生抗体与病毒的共进化和抗体亲和力成熟因此，目

32、前仍未能通过MPER&位展示法免疫伏得广诺中和抗体本研究利用机乱旋素B亚.笔(CTB)作为栽体展示MPER表位的研究.为后续HIV-1时MPER作为候选疫苗的探索奥定基础09参考文献1(-htvkleyMA.UittgcB(；.FtwdE().HIV-1rinrlo|>rgly(v<»|>nHtainbimynthcsiBvtrafficking,andincoqM>rationJJMolBiol.2011.410(4)：582-608.2HonsignoriM.H/angKK.(JimX.rtal.AiialK</arkwiallineup*M

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