鸡传染性支气管炎耐热活疫苗的研究.docx

1、鸡传染性支气管炎耐热活疫苗的研究收稿日期：2009-09-17修回日期：2009-10-20公金项0:科技部科技型中小企业技术创新*.（00026231101115）秦玉明，王利永，朱良全，王栋（中国善医药品监察所，北京100081）摘要：应用鸡传染性支气管炎病毒（H%株）与不同耐热保护剂配方和冻干曲线进行筛选。结果表明：采用冻干曲线2和耐热保护剂WXS冻干鸡传染性支气管炎病毒Hu弱毒疫苗效果最佳。试制耐热活疫苗3批，其各项检验均符合要求。耐老化试脸表明：经过371放置10d的每羽份病毒含量下降0.0.8个滴度，每羽份病毒含量达10"1（户EID*保存期试验表明:281:保存24个月

2、疫苗每羽份病毒含量下降0.4-0.6个滴度，每羽份病毒达EIDo疫苗28P保存24个月后效检抗体水平达到1：1A1：32。免疫持续期试脸表明：免疫21日龄SPF鸡，6个月后血清中和抗体效价达到1：321：6牝田间试验表明临床观察无不良反应，安全有效。特异性试验表明耐热活疫苗抗原性不变。耐热保护剂生物学和理化特性表明保护剂安全、稳定，室温保存期达3个月。关键词：耐热保护剂；鸡传染性支气管炎病毒（H於株）；活疫苗StudyonThermo-tolerantLivingVaccineofAvianInfectiousBronchitis*QINYuming,WANGLiyong.ZHULiangqu

3、an,WANGDong*通讯作者,Email：wangdongQINYuming,WANGLiyong.ZHULiangquan,WANGDong*通讯作者,Email：wangdong(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081)Abstract：Avianinfectiousbronchitisvirus(IBV)attenuatedstrain(HJ2)wasselectedbyfreeze-dryingexperimentsblendingwithdifferentsuspendingmediaandlyophilizatio

4、ncurves.Tlie1BVattenuatedstrain(H>j)choosedbyWXSandlyophilizationcurve2wasmostfavorable.Threebatchesofthermo-tolerantlivingvaccineofIBV(HQproducedbyWXSandlyophilizationcurve2weretestedeligible.Theheat-resistingtestshowedthatthetiterofvirusreduced0.6to0.8EIDjoperdoseafterstoringat37幻for10daysandst

5、illremainedIO47to10s1EID”perdose.Theexperimentofthepreserverperiodreflectedthatthetiterofvimsreduced0.4to0.6EIDperdoseafterstoringat4°Cfor24monthsandstillremained10*1toIO41EID”perdose.Thetiterofneutralizationseraantibodyremained1：I6to132afterstoringat2to8丁for24months.Theimmunitylastingtestindic

6、atedthatimmunizingSPFchickensat21daysage,thetiterofneutralizationseraantibodyreached132to1：64after6months.Thefieldlestshowedthatthermo-lolcrantlivingvaccineofIBV(H52)wassafeandeffective.ThespecificitytestshowedthatinfectiousbronchitisstandardpositiveserumcanspeciallyidentifyitThebiologicalcharacters

7、andphysical&chemicalcharactersrevealedthethermo-tolerantstabilizerwassafeandstable,andcouldbestoredatroomtemperatureforthreemonths.Keywords:thermo-tolerantstabilizer；avianinfectiousbronchitisvimsattenuatedstrain(Hn);livingvaccine鸡传染性支,管炎冻干活疫苗是我国目前使用量较大的禽用疫苗。其产品要求在-151保存和运输，就我国目前基层县、乡、村的防疫条件而言，实际

8、上很难完全达到此条件。冻F活疫苗在温差比较大的环境下运输、保存和使用往往造成病毒失活，免疫效力降低。而同类进口产品均已实现在281保存，有效期达24个月，因此迫切需要研究一种新型的耐热冻干保护剂，提高国产常规疫苗的耐热性能。本研究以鸡传染性支气管炎病毒Ek株为模型，进行了比较试验，现将试验结果报告如下。1材料鸡传染性支气管炎病毒Ha株、检验用强毒M41株、中和试验标准毒为MN株均购自中国兽医药品监察所；7、14和21日龄，鸡，10日龄SPF胚购于北京市实验动物中心；常规的鸡传染性支气管炎Ha株活疫苗3批，购于北京市兽医生物药品厂（批号为1999-107-4.1999-107-5.1999-10

9、7-6）；进口鸡传染性支气管炎冻干活疫苗为荷兰英特威公司生产（批号为03-1999.43）；鸡传染性支，管炎病毒阳性血清购口中国兽医药品监察所。无萌检验用硫乙酬酸盐培养基（T.G）、酪豚琼脂（G.A）和葡菊糖蛋白豚汤（G.P）购于中国兽医药品监察所培养基室。支原体检验用Frey氏培养基均由本实验室制备°仪器设备为冻干机（Edwards公司，Lyoflex2.0）.水分测定仪（METTLERTOLEDO）、76-1型高频电火花真空度测定仪。2方法2.1制苗用毒液的制备按中华人民共和国兽用生物制品规程（以下简称规程方法进行）。2.2耐热冻干保护剂筛选和冻干曲线优化在不同保护剂基质与病毒相

10、容性研究的基础上，采用3种不同配方耐热保护剂（WXS、AZW.BZW）和2种冻干曲线分别冻干，冻干后再进行耐老化试验和物理性状与水分含拈测定，筛选出最佳保护剂配方和冻干曲线。按照筛选出的最佳保护剂配方和优化的冻干曲线试生产3批鸡传染性支气管炎（HQ耐热活疫苗，按规程进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、安全性检验、效力检验、剩余水分和真空度等常规项目检验。冻干曲线1：产品-5P进箱,-40%：维持4h,产品由-40P升至-10%：维持10h,板层温度提高到28P,全程24h。冻F曲线2：产品CH5K进箱，以每分钟1%：的速度降至-4（）P或者以下，维持4h,板层温度控制在-10X2

11、,维持1416h,以每2h升温10忙,板层温度在25专维持6h出箱，全程30-32h0耐老化试验对实验室制备的3批疫苗，毒批随机抽取疫苗1（）瓶，其中5瓶测疫苗效价，另外5瓶置37%：保存10d,按规程要求进行病毒含量测定，确定疫苗的热稳定性。同时将3批常规鸡传染性支气管炎活疫苗（H52株）及1批进口疫苗作为对照。2.3 保存期试验对实脸室制备的3批疫苗置28I分别保存6、12、18、24个月，然后按规程要求进行病毒含量测定，确定其稳定性。2.4 免疫效力检验对实验室制备的3批疫侑在28P保存24个月后免疫SPF鸡，每批疫苗均滴鼻法免疫21日龄的SPF雏鸡10只，每只鸡1个使用剂量。在免疫14

12、d后采血并分离血清，按规程”:要求测定血清的中和抗体效价。2.5 免疫持续期试验将实验室制备的3批鸡传染性支汽管炎（H慝株）耐热活疫苗和常规国产H52疫苗（批号为1999-107-5）分别免疫21日龄SPF鸡6个月后采血，分离血清。按规程要求测定血清的中和抗体效价。2.7特异性试验将实验室制备的3批疫苗，每批分别抽取5瓶.用生理盐水稀释至0.1只份/0.1mL,与等成抗鸡传染性支气管炎特异性血清混合，在251作用lh,分别于尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚（）.2niLo耐热保护剂的生物学和理化特性测定将耐热保护剂WXS在25P下保存30、60、90d,测其氨基氮的含量、pH值，及其

13、冻干活疫苗在冻干前、后疫苗病毒滴度的变化和耐热性能。2.8 田间试验选择吉林、广东、夭津等3个省份不同鸡场3.7万只鸡，用本实验室制备的鸡传染性支7管炎耐热活疫苗按瓶签要求稀释，进行饮水免疫，并进行临床追踪观察。3结果耐热冻干保护剂的筛选和冻干曲残优化结果鸡传染性支气管炎（HQ毒株采用WXS配方耐热保护剂与优化的冻干曲线2,预冻效果最好，冻干后外观不结晶，37%：保存10d也不萎缩，符合生物制品物理性状的要求。其它2种配方冻干后外观已经不合格，故未进行病毒含址的测定。将外观合格的产品进一步进行耐老化试验，用WXS配方制备的疫苗病毒滴度下降较小,表明其耐热性能更佳，具体见表lo表1耐热冻干保护剂

14、的筛选和冻干曲线优化结果>±：表榆狷保护刑种类冻干曲城1流干曲线2潦干后37P10d冻干后37110d效力外现效力外观效力（EID、/只）外观效力（EIDJ只）外观WXS有少量结晶表面有片状物.部分要爆10”未见堵肝1O5*不要煽BZW.J11/2见结册表面下凹.大部分萎缩1俨上1/3结晶表而平坦10”大部分羲缩AZW上1/3结品表面卜凹大部分要缩IO1,上1/3结品表面下凹泌、大邠分英缩芥慵牛奶.上1/3结晶严重萋给10*'未见结晶1伊严柬萎娜3.1 疫苗常规检验结果采用WXS配方耐热保护剂和优化的冻干曲线2,制备的3批鸡传染性支气管炎病毒（H&株）耐热活疫苗

15、（批号为9901.9902.9903）进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、剩余水分含量测定和真空度检验等常规检验，结果均合格，具体见表2。表23批疫苗的常规检验结果批号物理无南支原体外源病安全剩余夏空效力检验性状检脸检验毒检验检验水分度（E1DJ只）9901微红色疏无菌阴性阴性10/101.99%合格1O*1松海绸状健活9902缴红色成无的阴性阴性9/101.87%合格10*'松海绵状健活*9903微红色跋无菌阴性阴性9/101.75%合格10*7松海绵状他活、注：A24h内死亡3.2 耐老化试脸结果实验室制备的3批耐热冻干活疫苗和荷兰的英特威公司与国内同类产品同时进行耐

16、老化试验。实验室制备的3批疫苗冻干后笛羽份病毒含量达EIDso.37r保存10d,其疫苗每羽份病毒含量下降了0.6F.8个滴度。国内同类常规牛奶、脱脂牛奶保护剂的疫苗则分别下降了2.42.6个滴度。国外进口1批疫苗下降1.2个滴度（见表3）。3.4保存期试验结果实验室制备的3批耐热活疫苗于2TP保存«33批疫苗耐老化试验培果EID./只批号疫苗毒价37r10d疫苗毒价990110*'10°990210°10,99903i时V英特威10°10”1999-107-410°10*1999-107-510°10”1999-107-61

17、0*'10°24个月后，每羽份病毒含哒仅下降0.&W.8个滴度,每羽份病毒含量仍达到10'10"EID,）,符合规程要求（每羽份病毒NIO"EIDso）。国内常规疫苗在28K保存6个月就已经不合格。国外同类产品保存24个月后每羽份病毒含量也仅下降0.6个滴度（见表4）。表43批疫苗保存期结果EID/只28P（月）注：未佐测批号原始效价6121824990110*'10"104'10°10°990210"104,104'10°10*'990310。10*710&

18、#176;10°英特威10*7叶1俨10*'1999-107-410°101'101*.1999-107-510。10*'炉1999-107-6to*11尹1O1'.*3.5免疫效力检验结果实验室制备的3批鸡传染性支气管炎Hsz耐热活疫苗经28P保存24个月后，经血清中和抗体效价检测仍达到1：16,均达到规程要求（>1：8）的质场标准，对免疫鸡群仍起到很好的保护作用（见表5）。表53批疫苗的效力检验结果.28r24个SPF格纶唆免检利仙、途捋采时间.血清中和抗体效价供'月（EID»/H）（只）9901Wli1021IO

19、*5EIIX/只的免疫后1:16-3299021()*'|>21梅森液滴昴免疫14d1：16990310*'10211：162.6 免疫持续期试验结果用实验室制备的3批用传染性支y管炎耐热活疫苗免疫鸡,6个月后采集血清其中和抗体效价测定结果均N1：16,与常规对照疫苗相一致。具体结果见表6。哀63批疫苗血清中和抗体效价测定结果批号原始牧价（EIIX/JI）采血H龄dliil中和SPFK(个)(ml.)中相抗体结果99011(尸2(K)湘峰和1：1612«».299021OV稀#分别，120.2>1：169903i(r100Eld中fB12().2

20、耕毒对照66/6死r.正常对照66/6ft!活田间试验检测姑果3批疫苗在3个省份田间试验中临床观察和病例剖检结果表明鸡传染性支气管炎耐热活疫苗对免疫鸡群安全、有效、质里可控。具体结果见表7。表73批疫苗田间试验结果批号接冲途径数M效梨疑察吉林990130饮水2、只好排免校后35.Ed.分别利校广东990235挟水0.9)1只5只妗.嗾头、气管、支丁管无水天津990330伏水<».«万只肿、出血.玷液地务等病变."生产网期未见界常。it明：将传染性支'（管炎耐熙活授尚*免疫相安全.有效3.8特异性试脸结果将实验室制备3批鸡传染性支气管炎耐热活疫苗稀释后与等破阳性血清中和，再接种SPF鸡胚24h后均存活，证明特异性检噩合格（见表8）。3.9 耐热保护剂生物学和理化特性的测定结果将筛选好的WXS配方在25P保存30.60和90d,其理化特性未发生改变,再与鸡传染性支气管炎病毒制备的耐热疫苗比较其耐热性能未发生明显改变，安全性能没有改变，均符合规定，其体结果见表9。表83批疫苗的特异性检测皓果ii：A24h内此亡批号冻后稣始效价（EI1WH）中和剖检"活率99011俨用生埋找水稀仲至成察144h./$9/10*99020.1羽mL.M肝航儿未北失10/10990