食管癌疫苗抗癌机理研究.docx

1、食管癌疫苗抗癌机理研究作者单位:河北联合大学(河北省唐山市063000)化市第二医院;唐山市人民医院本文课题受河北省科技支撑计划项目(编号：09276418D-18)资助通信作者:张庆波zqb1955马淑芹风郑全辉张庆波幺文博刘洪梅杨雷刘丽摘要目的：对食管癌可溶性抗原和超抗原SEC构建的肿瘤疫苗的抗癌机理进行研究。方法：培养食管癌细胞Ecal09,提取其抗原成分，和超抗原金葡素SEC构建成肿瘤疫苗；分离人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),经肿瘤疫苗联合作用，进行体外培养，进行增殖，成为效应细胞；流式细胞术(FCM)测定效应细胞表型；细

2、胞毒试验检测其杀伤活性，FCM测定效应细胞诱导靶细胞凋亡情况。结果：经肿瘤疫苗刺激的淋巴细胞组增殖活性最强，于72h达到高峰，并且上调CTLs中CD8丁细胞群。肿瘤疫苗刺激的淋巴细胞组诱导的CTLs对靶细胞杀伤活性显著高于单纯淋巴细胞组(P<0.01)o经效应细胞作用后，靶细胞的凋亡率为32.44%,而对照组仅6.38%的细胞凋亡，具有统计学差异(P<0.01)o结论:食管癌抗原与超抗原构建的肿瘤疫苗能诱导效应细胞明显增殖、活化、并产生高效、特异的抗肿瘤效果，效应细胞可诱导靶细胞凋亡，从而发挥抗癌作用。关键词肿瘤疫苗食管癌肿瘤可溶性抗原超抗原SEC生物治疗doi:10.3969/j

3、.issn.l000-8179.2012.24.020AnticancerMechanismofEsophagusCancerVaccineShuqinMA",QuanhuiZHENG1,QingboZHANG'WenboYAO2,HongmeiLIU2,LeiYANG3,LiLIU3Correspondenceto:QingboZHANG;E-mail:zqbl955"BasicMedicineCollegeofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,2TangshanPeopleHospital,Tangshan063009,3

4、ZunhuaNo.2Hospital,Zunhua064200,ChinaThisworkwassupportedbytheScienceandTechnologySupportProgramofHebeiProvince(No.09276418D-18)AbstractObjective:Thisworkaimstoassesstheanticancermechanismofesophaguscancervaccineforclinicalapplication.Methods:Esophaguscancercellswerecultured,andthesolubleantigenswer

5、eextractedfromthem.EsophaguscancervaccinewasconstructedwiththeantigenandsuperantigenSEC.Lymphocyteswereisolatedfromperipheralblood,andthenstimulatedwiththevaccineinvitro.PhenotypesofthecellswerecheckedbyFCM,andkillingactivitywastestedwithcytotoxicassay.Apoptosisoftargetcellswereinducedbyeffectcellsc

6、heckedwithFCM.Results:Theproliferationofthelymphocytegroupstimulatedbythevaccineisthestrongest,whichpeakedat72h,thusraisingCD8*TcellpopulationsofCTLs.Thekillingactivityofthelymphocytegroup,whichisstimulatedbythevaccineagainsttargetcellsissignificantlyhigherthanthatofthelymphocytegroup(PvO.Ol).Apopto

7、sisoccurredin33.44%ofthetargetcellsafterinductionoftheeffectcellsand6.38%inthecontrolgroup.Thereisasignificantdifferencebetweenthem(PvO.Ol).Conclusion:ThetumorvaccineconstructedwithesophaguscancerantigenandsuperantigenSECcaninducePBMCtoactivateandproliferateintoCD8*CTL,withspecificcytotoxicityagains

8、tthecellsfromwhichtheantigencomesfrom.TheCTLinducedbythevaccinecanresultintheapoptosisoftumorcellsastargetcellsfortheactionofanticancer.KeywordsTumorvaccine;Esophaguscancer;Tumorsolubleantigen;SuperantigenSEC;Tumorbiotherapy全世界每年约30万人死于食管癌，我国食管癌病死率为15.02/10万，是全世界病死率最高的国家之一。由于肿瘤本身的侵袭和复发的生物学特性，传统的手术、放

9、疗和化疗的治疗效果不能令人满意。随着免疫学理论和分子生物学知识的不断发展，生物免疫疗法成为控制和消除肿瘤的新途径。本研究应用食管癌肿瘤可溶性抗原(tumorsolubleantigen,TSA)联合超抗原金葡素C型(staphlococcalenterotoxin,SEC)构建肿瘤疫苗，刺激T淋巴细胞，诱导产生细胞毒性T细胞(cyctotoxieTlymphocyte,CTL)，对肿瘤细胞进行杀伤，从而探讨该疫苗的抗癌机理,为临床应用提高其疗效建立理论基础O1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂超抗原金葡素SEC(药品名：金葡液，购于沈阳协和集团)，CCK-8(武汉碧云天公司),异硫缸酸荧光

10、素（HTC）标2的CD19/CD3/CD4/CD8（美国BD公司）ELISA试剂盒（美国R&D公司），淋巴细胞分离液（天津TBD公司）,RPM1-1640（Gibco公司）H-Tdr（中科院原子能所M1.1.2肿瘤细胞系人食管癌细胞株EcalO9,Hela细胞株由本校免疫学实验室提供。1.2方法1.2.1食管癌TSA的制备用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）培养食管癌细胞株Ecal（）9,胰酶消化，用预冷的PBS洗细胞一次（1000转/分），加入3MKC1（破碎细胞）,4K摇床振摇过夜,12000转/分离心取上清，透析，离心,取E清加入等量4M硫酸铉沉淀蛋白质,透析，去除硫酸

11、铉,用紫外分淀光度it280nm波长下测定蛋白含量，作为TSA。经0.45puM微孔滤膜过滤除菌,保存-80T备用。1.2.2PBMC的分离正常献血苫外周血，肝素抗凝,fIIEicoll细胞分离液（比重:1.077）密度梯度离心，常规法分离WMC用无前磷酸盐绥冲液（PBS）或生理盐水洗细胞三次，计数细胞数，加入含10%人AB型血清的KPMI-164（）培养基中.根据需要:调细胞浓度。1.2.3食管癌疫苗的构建分别用不同浓度的TSA和SEC刺激PBMC增殖，用CCK-8比色法测定其增殖，结果发现用50|ig/mL的TSA和0.1ng/mL的SEC增殖活性最强，肉此选取最佳浓度的TSA（5（）pc

12、g/mL）和SEC（0.1ng/mL）混合成为肿瘤疫苗。1.2.4淋巴细胞增殖的测定实验分四组：A组：PBMC;B组:SEC+PBMC;C组:TSA+PBMC,D组（疫苗组）：SEC+TSA+PBMCoSEC浓度0.1ng/mL,TSA浓度5（）pig/mL用完全RPMI-1640培养液调整淋巳细胞浓度为lOVmL,接种于96孔板，每孔100皿,各组设5复孔。分别培养24、48、72、96h使用CCK-8比色法测定细胞增殖。1.2.5细胞表型分析完全RPM1-1640培芥液调整细胞浓度为107n）L,接种于6孔板，每孔按I：述分组，每组4孔，培籍第3天,每组各孔分别加入EITC标记的CD19/

13、CD3/CD4/CD8,流式细胞仪检测°1.2.6细胞辰活性检测4组刺激培养诱导的CTLs作为效应细胞，调JI；细胞浓度为2x107n）L,分别与Ecal09（lxlO5）.Hela（IxlO5）共同加于96孔板中,效:靶=20：1,另设效应细胞对照组和靶细胞对照组,每组3复孑L培养24h后，CCK-8法测各组效应细胞对肿痛细胞的杀伤率c肿瘤细胞杀伤率筋）=1-（实验组OD值-效应细胞组01）值）"靶细胞组0D值X100%1.2.7流K细胞仪检测细胞凋亡效应细胞与靶细胞作用,另设单独效应细胞和靶细胞作为对照,24h后将细胞收集到10mL的离心管中,每样本细胞为5xlOVmL

14、加入annexinv染色液5|xL,室温卜避光孵育15min,流式细胞仪分析（激发光波长488nm）1.3统计学处理实验结果以劣±s表示，应用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理,多组间数据比较采用方尺分析2结果2.1不同刺激物对淋巴细胞增殖的影响96h内,不同时间点各组体外培养的淋巴细胞增殖能力不同（图1）,在2472h,各组淋巴细胞增殖能力随时间的增加而增强各实验组均V72h时细胞增殖最显苫（PvO.05）,到96h时，淋巳细胞增殖趋势汗始下降。同一时间点，各组淋巴细胞增殖能力也不同,经食管癌TSA、超抗原SEC联合刺激的D组与A、B、C组比较,细胞增殖活性最高，F72h达

15、到高峰图1不同时间各组细胞增殖测定FigureICellprolif(,rati(»natdiflrrenllimepoints2.2细胞表型分析不同刺激条件下细胞培养3I后诱导的CTLs细胞表型分析可见（表1）:4组CD3均为阳性表达，表明所诱导的细胞为T细胞对照组A的CD8只彳i26.31%,而B、C、D三组较之明显升高（P<0.05）,1）组诱导的C1）8最高,为39.19%，说明所诱导的细胞为CD8TTL细胞。表1细胞表型分析.、*(%)lablfIl*h<*n()lpcoftheefffdorcell>枷CD3CD4-Cl)8A组73.82±3.

16、4041.15±4.402631±3.2()B组83.48±1.6()42.20±2.8534.27±3.04*C组81.24±1.8443.19±0.9135.3()±2.94*D组80.24±1.9046.55±2.«039.19土1.94*'jA组比较*/><0.()52.3效应细胞对靶细胞的杀伤效应经食管癌TSA、超抗原SEC联合刺激的I）坦诱导的CTLs对靶细胞Ecu109杀伤活性显甚高于单纯淋巴细胞组(P<0.01,表2),效应细胞对Eca109的

17、杀伤率明显高F对Hela细胞的杀伤率(P<0.01),这说明D组具有高效、特异性的杀伤作用。表2效应细胞对靶细胞的杀伤率比较*(%)Iul»lc2(Alotoxicityoletlrctorcellstotargelrrlls分组ECA109HelaA组79.27±5.5777.56±3.27B3i80.20±3.158!.20±5.l5c组H2.64±3.9480.02±2.78D组9736±2.11*85.72±4.16*与其他组比较<0.()12.4流氏细胞仪检测细胞凋亡结果培养24h后

18、，将对照组中的效应细胞和靶细胞混合成为效靶未作用的细胞，实验组为效靶作用的细胞。分别取5x10”个细胞置10mL的离心管中离心,annrxinv染色,流式细胞仪分析结果发现经效应细胞作用后,32.44%的细胞发生凋亡，而对照组仅6.38%的细胞凋T:,具有统计学差异(P<0.01)o3讨论肿瘤疫苗的研究已有一百余年的历史，受启发于病原菌疫苗。最初采用肿瘤组织细胞,经物理(射线照射)或化学药物(环磷酰胺等)处理杀死肿瘤细胞，成为肿瘤疫苗存在问题一是效果不确切；二是处理盛度过大，会降低肿瘤疫苗的免疫原性,过小则会导致肿瘤细胞的种植；三是病毒相关肿瘤,经物化法处理后,细胞死仁，但其病成存在细胞

19、内，作为疫苗有潜在危险O为解决上述后两种问题，美国选用多肽作为疫苗,是第一个被美国EDA批准的肿瘤疫苗，其缺点是免疫原性差，特异性不强。因此，探明肿瘤疫苗的抗癌机制，提高肿瘤疫苗的免疫原性和特异性,是研制肿瘤疫苗的关键。提取肿瘤细胞内蛋白成分作为抗原，可避免细胞抗原的各种弊端,保存抗原的特异性，加入葡萄球菌肠毒素(超抗原)可诱导T细胞增殖"，提高其免疫原性金葡菌肠性素(SE)是-种具有高度生物活性的蛋白质,是目前研究较多的细菌性超抗原,对肿瘤细胞产生直接和间接的杀伤和抑制作用由肿瘤可溶性抗原和金葡菌超抗原构建的肿瘤疫苗,可诱导人外周血.单个核细胞产生细胞席性T细胞,这种效应细胞对抗原

20、来源的肿瘤细胞具有选择性杀伤活性"L肿瘤疫苗基本上分为细胞抗原疫苗、蛋门抗原疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、重组疫苗、抗体疫苗、复合疫苗、树突状细胞疫苗等7。由食管癌TS和超抗原SEC构建的肿瘤疫钏A复合疫苗，该疫苗可诱导PBMC活化增殖，产生Cl)8T细胞.该细胞通过诱导靶细胞凋亡,对靶细胞产生选择性杀伤作用。尽管人机体内存在着一系列的免疫监视机制.但是由于肿瘤细胞在长期的生长演变过程中,形成r逃避机体免疫系统的机制，肿瘤细胞町通过多种方式来逃避免疫监视.目前已经认识到的肿瘤免疫逃逸的相关机制可能包括以下几个方面«：i)肿瘤抗原表达缺陷或抗原调变，异质性大；2)肿

21、瘤细胞MIIC-II类分子表达不同程度的下降、缺如,1L分化能力差的肿瘤细胞HLA表达更弱，大多数实体肿瘤不表达HLA-II分子抗原;3)肿瘤细胞产生的细胞因子的负性调节作用，分泌某些因子如TGF-8JL-10、血管内皮生长因子(VEGF)等;4)Fas/FasL在肿瘤免疫逃逸中的作用，表达的肿瘤细胞能诱导表达Eas的淋巴细胞发生凋亡，乂由于瘤细胞本身表达的下调，使淋巳细胞促肿瘤细胞凋亡的作用处丁弱势；5)粘附分F7共刺激分子缺陷，使得T细胞住活化过程中缺乏第二信兮而不能被仃效的激活，不能激发起仃效的抗肿瘤免疫应答;6)抑制性免疫细胞亚群的作用.抑制性细胞亚群包括：近年来被广为研究的调廿性细胞

22、(Treg)，肿瘤相关I：噬细胞(TAM),愉系来源的抑制性细胞(MDSC)等H-,2O这些方面作用导致了机体无法对肿瘤细胞进行有效的识别和杀伤。肿瘤细胞表达肿瘤抗原是诱发机体肿瘤免疫应答的关键.肿瘤抗原需由MHC分子递呈，并被T细胞识别，机体通过肿瘤抗原激活CTL接杀伤肿瘤细胞或激活B细胞分泌抗体产生特异性的免疫应答，但大多数肿瘤抗原的免疫原性很弟i，且宿主对肿瘤抗原的免疫应答导致肿瘤细胞表面抗原减少或丢失,从血使肿瘤细胞不被免疫系统识别，不能诱发有效的抗肿瘤免疫应答作用。基这个认识，需要运用增强肿瘤抗原的免疫原性的方法，诱发机体的抗肿瘤免疫应答，以达到缩小和消除肿瘤的0的。参考文献1黄物，

23、尹文.张秀敏.等.葡萄球菌肠毒索A体内诱导小鼠T细胞增殖的实骑研究J现代肿瘤医学,2009,17:28-31.2 PcraboFG.WillenPL.WirgerA,etal.Preclinicalevaluationofsupcrantigen(staphylococcalenterotoxinB)intheintravesicalimmunotherapyofSuperficialbladdercancerJ.Ini|Cancer.2005.115(4):591-598.3 PumphreyN,VuidcpotA,JakobsenB.etal.Cuttingedge:Evidenceofd

24、irectTCRalphachaininteractionwithsuperaiitigenQ.|Immunol,2007,79(5):2700-2704.4 ThammDEI,KurznianID.MacewenEG,cial.Intralesionallipidcomplexedcytokinc/Superantigcnimmunogenetherapyforspontaneouscanincturmorsfj.CancerImmunlinnninother.2003,52(8):473480.5张庆波，么文博,徐卫国，等.可溶性抗原联合超抗原诱导的CTL抗痛作用的实验研究J现代肿瘤医学,

25、2012,20(7):1340-1343.6刘洪梅，张晓群,刘亚楠，等.胶质瘤抗原联合超抗原SEC诱导杀瘤性免疫细胞的实验研究J.中国肿瘤临床,2011,38(6):301-303.7 Mosca町，LyerlyHK,ClayTM,etal.DcntriticcellvaccincQ.FrontBiosci,2007,12:4050-4060.8 HiihnelPS,ThalerS,AntuncsE,etal.TargetingAKTsignalingsensitizescancertocellularimmunotherapyJ.CancerRes,2008,68(10):3899-3906

26、.9 BronteV,MocellonS.Suppressiveinfluencesintheimmunere-sponsctocanccrJ.Jimmunother,2009,32:111.10 RosenbergSA.NewopportunitiesforthedevelopmentofcancerImmunotherapiesJ.CanccrJSciAm,1998,4:sl.11 NomuraT,SakaguchiS.NaturallyarisingCD25+CD4+regulatoryTcellintumorimmunityJ.CurrTopMicrobialImmunol,2005,

27、293:287-302.12 LiuZ,KimJH,FaloLD,ctal.TumorregulatoryTcellspotentlyabrogateantitumorimmunityQ.JIminunol,2009,182(10):61606167.(2012-1018收稿)(2012-12-10修回)(本文编辑:郑莉)（上接第2065页）gliomacorrelationofnestinwithprognosisofpatientsurvivalJ.SurgNeurol,2007,68:133-143.3 ShmizuT,SugainaraK,TosakaM,ctal.Nestinexpressioninvas-cularmalfbrmationsanovclmarkcrforproliferativeendothcliumQ.NeurolMedChir(