鸭疫里默氏杆菌疫苗的研究概况.docx

1、鸭疫里默氏杆菌疫苗的研究概况李雪岚'，王静。闫丽辉，2,鞠妍七朱庆虎L2(1.哈尔滨维科生物技术开发公司，哈尔滨150069;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001)DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2013.12.002鸭疫里默杆菌病由鸭疫里默氏杆菌(Riemerhanatipes-tifer.RA)引起鸭的主要细菌性传染病之一，药物预防和免疫预防是我国目前控制该病的主要措施，但药敏试验表明RA已对生产上的大多常用药物产生耐药性。近些年来，国内外学者都致力于RA疫苗的研究，目前国内外研制成的RA疫苗有单价和多价灭活菌苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗等。

2、由于RA血清型众多，各血清型间无明显交叉保护力，再加之不同地区间流行的血清型也不一致，商品化的RA疫苗虽具有一定的应用前景，但疫苗缺乏普遍性，具有一定区域局限性，往往造成疫苗免疫效果欠佳，从而影响了疫情的防控。本文综述了RA疫苗研究现状，并探讨RA疫苗今后的研究方向。1 RA活疫苗活疫苗是动物快速防疫的主要方式，因其含有的抗原是活的病原微生物，对机体能迅速产生免疫力，但在兽用活疫苗产品中病毒类占据较大比重，而细菌性产品较少，特别是RA的活疫苗报道的更少。由于人工致弱毒株偶尔会出现毒力返强现象，或由于操作不当，易造成人工散毒,RA弱毒苗的应用存在局限性,所以国内外学者对此研究的较少。Sandhu

3、等(1991)曾报道，利用筛选到的自然弱毒株1、2和5型菌株，制成三价弱毒疫苗，免疫北京鸭的相关实验室及生产应用研究.该疫苗给1日龄北京鸭经饮水或气雾免疫一次均能产生有效保护力，其免疫保护期最少可至42日龄。经实验攻毒和野外感染试验均表明两种方法均可产生较好的保护作用。免疫之后在饲料中添加0.044%的金霉素或0.02%的磺胺二甲氧嗜呢,不会影响疫苗的效果。国内多以樱桃谷鸭为主，其饲养周期在35-40日龄.与油乳剂灭活苗相比，应用该苗不仅可以减轻因为疫苗注射造成的应激，还能减少注射次数,确保胴体品质。据了解该疫苗已在美国、加拿大等国家上市销售使用。Higgins(2000)等通过动物免疫试验和

4、淋巴细胞转移试验证明,2型RA弱毒疫苗免疫可导致相对较长时间的细胞免疫应答。弱毒疫苗不仅可以诱导机体产生体液免疫，而且还能诱导产生细胞免疫，免疫效果较灭活疫苗更有优势。2 RA灭活疫苗灭活疫苗是将人工培养得到的抗原用甲醛等灭活后，加入适当佐剂制成。当前国内市场中RA疫苗均为灭活苗，免疫效果都很理想。不同产品间的差别主要在于血清型的不同，佐剂和抗原含量不同。2.1RA单份夜蓄由于RA的血清型众多，国际上目前已确认有21种,还有新的血清型或血清亚型待确认，而且许多实验表明各血清型间无明显交叉保护力。因此，对于单价疫苗来说，必须依据不同地区间流行的血清型和流行菌株，针对性的制备疫苗,才能获得良好的保

5、护效果。苏敬良等(2000)以1型RA分离株为菌种研制了1型单价油佐剂灭活疫苗，免疫7日龄雏鸭后14、24d用相同血清型强毒攻击，保护率达90%100%。单价疫苗免疫后2周内，抗体水平持续上升，从第3周开始缓慢地下降,5周时仍然维持在较高水平。通过攻毒保护试验和抗体消长规律的测定表明,RA油佐剂灭活疫苗具有良好的保护效果。赵朴等(2010)从病鸭分离RA并制备了蜂胶灭活疫苗,试验结果表明免疫后37d即可产生部分保护(1/10-4/10),I4d可完全保护(10/10),到90d仍可完全保护(10/10)o杨灵芝等(2011)以10型RAGN52株为曲种，采用改进的液体培养工艺进行增菌后，制备油

6、乳剂灭活疫苗免疫3日龄雏鸭，免疫后7d用同源菌株攻击保护率可达70%,143达100%,至56d免疫保护率仍可达80%o于10日龄进行第2次免疫，二免后3d免疫保护率达100%。王小兰(2012)用候选的YL4、JY4、CH3、CQ3、YXbl2五株RA分离株分别制备灭活油乳剂疫苗,分别于5日龄和18日龄对樱桃谷鸭进行2次免疫后，免疫鸭均能够产生高水平的RA特异性抗体，且对2LD5OJY4或CH3攻毒产生很好的保护效果,其中由CH3、CQ3和YXM2制备的灭活油乳剂疫苗对攻毒的保护率高达100%o同年，又用SC-2、Yb2、Th4、JY-l、NJ-3菌株作为疫苗候选株制备灭活油乳剂疫苗后免疫5

7、日龄雏鸭,2周后进行加强免疫，二免1014d后并进行血清抗体检测及攻毒保护试验。结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性EUSA抗体和攻毒保护力,但是攻毒保护性差异较大,NJ-3免疫后的攻毒保护性最好。22多份灭活疫蓄不同地区RA流行的血清型也不一致,而且在不同时期流行的血清型也可能不同，而且在同一鸭场，甚至是同一批鸭群可能同时存在多个血清型，并且各血清型之间缺乏交叉保护。同时考虑到菌体培养及内毒素等因素,疫苗生产中不可能加入全部血清型Mtto因此要发挥疫苗的最佳优势，就要在充分了解当地流行状况基础之上，选用包含流行血清型的多价疫苗进行接种。Sandhu和Layton(19

8、85)采用1,2.5三个血清型RA菌株制备的三价灭活苗，在雏鸭1、2周龄或2、3周龄时免疫2次，可达到70%85%的保护，而且2、3周龄时免疫比1、2周龄免疫可获得更高的保护率。但这种保护只能维持到免疫后2周。郭宇飞等(2003)采用四川等地流行广泛的RA1、2、4和5血清型菌株制备铝胶佐剂四价灭活疫苗免疫3日龄樱桃谷商品鸭，免疫后第10J3和16d免疫鸭对同源RA的攻击分别表现出5%-20%、75%90%和100%免疫保护力，第233&免疫保护力开始下降。用间接EUSA对免疫鸭进行抗体消长规律检测，表明3日龄樱桃谷鸭首免后第23d抗体达到高峰，至93日龄时仍能检出抗体。10日龄时进行

9、二免后可产生更高的抗体水平，到第65d时仍能保持较高抗体水平。何辉(2006)选择华南地区流行广泛的RA1、2、3和4型血清型菌株制备蜂胶佐剂四价灭活疫苗。对疫苗经无菌检验及安全检验合格后，颈背皮下免疫3日龄樱桃谷商品鸭，首免后3周抗体达到高峰,免疫鸭对同源RA的攻击免疫保护为11/1313/13,对异源RA的攻击保护力较弱，仅为1/133/13,有一定的交叉保护性。首免后2周时进行二次加强免疫可产生更高的抗体水平。对鸭只多次免疫后监测其凝集抗体变化结果表明，第一次免疫可刺激机体产生凝集抗体峰值，但后续免疫均无法达到该峰值。3联合疫苗3.1浆膜炎-胃妹奉性肝炎二联灭活苗陶淑珍等(2004)用自

10、然分离的2株RA接种含10%20%兔血清牛心汤琼脂培养基培养，收获菌液用甲醛灭活。用I型鸭肝炎病毒(DHV成种易感鸡胚收获含毒胚组液，经甲醛灭活后与灭活的RA菌液混合，制备3批油乳剂二联灭活苗，免疫2周龄雏鸭,2周后可测到DHV中和抗体,3周后攻毒保护率达95.8%(23/24)以上。RA3周后攻毒保护力87.5%(21/24)以上。雏鸭免疫12周后,RA攻毒保护率为75%(6/8),DHV攻毒保护率仍为100%(8/8)o32氏杆首璘-大船杆首二联夜笛由于鸭疫里默氏杆菌病流行时常常伴随大肠杆菌感染，为了控制双重感染，国内许多学者都开展了对RA和大肠杆菌二联苗的研制。吕敏娜(2006)用分离的

11、RA血清1型菌株和大肠杆菌(血清型078)制成鸭疫里默氏杆菌(1型)-大肠杆菌(078)二联蜂胶灭活疫苗。免疫试验结果表明,4日龄首免和11日龄二免，二免10d后可形成80%的保护率，免疫保护持续期达5周以上，可对肉鸭提供全程保护。维鸭于7日龄首免14日龄二免，攻毒保护率可达80%,对大肠杆菌078攻毒保护率达90%,田间试验的保护率可达99.8%。冯金牛(2011)用RA血清2型RA-gd35株和E.Coli078型E-gd21菌株制备鸭疫里默氏杆菌-鸭源大肠杆菌二联油乳剂灭活苗的研究,毒种连续传代.其毒力和免疫原性均保持稳定不变。10日龄的雏鸭进行首免颈部皮下免疫10只雏鸭，在免疫21d时

12、与同条件相同的对照组分别用RA-gd35株和E-gd21株进行攻毒试验，结果免疫保护率在70%以上，二联灭活苗首免21d后二免，二免后14d进行攻毒试验，结果免疫保护率在90%以L.o2次免疫后RA的抗体和E.Coli的抗体比1次免疫后的抗体水平高，且维持时间长。李淑娜(2008)采用四川地区RA优势菌株(B18.B112,B115)和禽大肠杆菌(E-Coli)常见标准血清型(01、02、018、078)成功研制了鸭疫里默氏杆菌-大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗，免疫鸭首免后7dRA和E.Coli的攻毒保护率分别为60%和50%,二免后7dRA和E.Coli的攻毒保护率分别为90%和70%o李振清

13、(2012)用RA10型LQ09.RA1型YC11和鸭大肠杆菌优势血清型菌株078型LQ06、092型BX02作为菌种，采用液体培养工艺进行增菌后，制备鸭疫里默氏杆菌-大肠杆菌的二联油乳剂灭活疫苗。对3日龄肉鸭雏鸭免疫可产生良好的免疫应答，免疫后10日龄用同源菌株攻击保护率可达70%,17日龄达80%,24日龄至出栏达100%；对7日龄肉鸭雏鸭免疫也可产生良好的免疫应答，免疫后14日龄用同源菌株攻击保护率可达80%,21日龄直至出栏达100%o4亚单位疫苗亚单位疫苗主要是采用提取或其它生物工程方法将KA病原体中引发机体免疫应答反应的主要成分制备而成的疫苗。此类疫苗，一方面减轻了常规全菌体疫苗存

14、在的免疫副反应问题.另一方面为进行精确免疫及多种病原体的联合免疫提供了新的发展思路,同时还为解决RA各血清型间的交叉保护性问题提供了一种新的方式。在RA亚单位疫苗方面主要开展了以荚膜或外膜蛋白为亚单位成分的免疫研究，但大多还处在研究阶段，保护效果也差异很大,这可能与研究者采用的提取方式及疫苗制备方式有关，有待于进一步研究。4.1芙JUUI疫原性苏敬良等(1998)对1型RA的荚膜提取物的免疫原性进行了研究，结果表明荚膜粗提物和经过苯酚抽提纯化后的荚膜提取物经2次免疫7日龄北京鸭后对同源细菌的攻毒保护率分别为90%和70%。采用ELISA检测荚膜提取物免疫后抗体产生规律显示，二者剌激机体产生的抗

15、体水平有一定的差异，荚膜粗提物免疫组抗体水平高于纯化后的免疫组，前者抗体下降速度较后者慢，后应用SDS-PAGE和Western-blotting分析超速离心法提取1型RA的外膜蛋白，证明44KD外膜蛋白可能是1型RA的主要免疫原性蛋白之一。而且还发现提取的44KD外膜蛋白的保护作用高于该菌的荚膜提取物。齐冬梅等(2005)用盐浸法提取了I型鸭疫里默氏杆菌的荚膜，用0.2mg/只(相当于5xIO,菌所提取荚膜量)进行免疫，可使8/10雏鸭得到很好的免疫保护。吕敏娜(2006)将RA菌液分别用十六烷基三甲基漠化铉(CTAB)-无水乙醇法和高浓度氯化钠浸提法提取荚膜多糖，用经95%酒精浸提7d以上

16、的蜂胶作佐剂,制备成RA荚膜多糖亚单位苗。疫苗免疫雏鸭未见不良反应，免疫5日龄的雏鸭，免疫后14d用RA-L强毒株攻击，保护率达80%;免口蹄疫疫苗研究进展商文*，周云峰2(1.吉林省梅河口市动物疫病预防控制中心，梅河口135000;2.吉林省镇奏县疫病预防控制中心，梅河口137300)DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2013.12.003口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)是感染猪、牛、养等偶蹄目动物的重要病原,在世界范围内引发急性、热性和高度接触性传染病一口蹄疫(Footandmouthdisease.FMD),给全球养殖业造成

17、巨大经济损失。根据FMDV血清学特性，可将其分为7个血清型，包括A型、0型、C型、SATK南非1型)、SAT2(南非2型)、SAT3(南非3型)和Asia1(亚洲I型)。研究已证实，各血清型之间抗原性存在差异，无交叉免疫现象，每一种血清型又包含若干亚型，同种血清型各个亚型之间仅存在部分交叉免疫保护°我国主要流行A型、0型和AsiaI,其中以0型FMDV感染造成的危害最为严柬。疫苗免疫接种是防控FMD的有效手段,开发安全高效的疫苗制剂是有效防控乃至最终消灭FMD的必要条件。FMD灭活疫苗因安全性好和免疫原性强等优点，目前应用较为广泛，对防控FMDV感染发挥着重要作用。近年来,随着分子生

18、物学和基因工程技术的飞速发展，对FMD疫苗的研制不断地深入和改进，亚单位疫苗、重组活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗和可饲疫苗等新型基因工程疫苗不断涌现,已成为FMD疫苗研究的重点和热点。1传统疫苗1.1天活我苗灭活疫苗是将毒株经病毒培养系统大量扩增后,再用灭活剂(甲醛、胺类衍生物)处理，使其丧失感染力，仍保持免疫原性,并添加佐剂乳化制成的一类疫苗。1947年.Frenkel首次采用牛舌上皮培养病毒抗原，成功制成FMDV甲醛灭活疫苗，用该疫苗接种牛群后发现其能明显降低FMD的发病率，该疫苗的广泛应用有效控制了当时欧洲FMD的流行态势，为当时FMDV疫苗的产业化提供了条件。1962年英国科学家开始

19、用乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21)培养口蹄疫病毒，生产口蹄疫灭活疫苗，并很快商业化。1966年Telling等应用BHK-21细胞深层悬浮培养法制备口蹄疫疫苗，可大量培养细胞、增殖病毒和制造疫苗。20世纪80年代用大型发酵罐培养细胞、增殖病毒和制备疫苗获得成功，这些使病毒快速、大量繁殖技术的诞生，成为口蹄疫灭活疫苗的迅速发展的基础。最早应用的FMDV灭活疫苗是经甲醛灭活而制成，但因甲醛对细胞具有毒性作用，且存在因灭活不彻底而散毒的可能性，因此推动了后来作用于核酸的N-乙酰乙烯亚胺(AEI)和二乙烯亚胺(BEI)作为灭活剂的研究。目前我国在牲畜口蹄疫强制免疫中主要应用细胞培养病毒的BEI灭活苗。灭活疫苗的缺点是热稳定性差，需要低温保存，免疫持续期短，抗病毒谱有限，不能区分注射疫苗动物和自然感染动物,同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。1.2眉