鸡传染性法氏囊病新型疫苗研究现状及发展趋势.docx

1、鸡传染性法氏囊病新型疫苗研究现状及发展趋势郁斌，闫志宪2,王培永3（1.江苏吴江出入境检验检疫局，江苏吴江215200;2.山东省鱼台县武台中学，山东鱼台272351;3.江苏省铜山县畜牧兽医站，江苏铜山221006）文章编号：1005-944X(2009)04-0073-03中图分类号:S858.3LS852.5鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3T2周龄的雏鸡与青年鸡，破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致不同程度的免疫抑制，从而使病鸡增加对并发和继发性病毒和细菌感染的易感性。1957年,该病首次在美国的特拉华州的甘

2、布罗镇的肉鸡群中发生，因此又称为甘布罗病。我国自1979年周蛟等人在北京郊区鸡场发现该病并于1982年分离出病毒以来，全国各地陆续有发生和流行的报道。但进入90年代后，IBD的流行情况日益复杂化，经典型、变异型和超强毒型三类IBDV在我国同时存在，出现了IBD的大面积流行和免疫失败。1研究现状1.1重组亚单位苗亚单位疫苗的主要原理是利用酵母、杆状病毒-昆虫细胞等表达系统高效表达并纯化病毒抗原蛋白，免疫机体后产生针对病毒的免疫反应。IBDV-VP2蛋白的亚单位疫苗的设计从最初的在大肠杆菌中表达，经历了原核、真核、酵母及昆虫杆状病毒载体等表达系统"叽动物试验证明重组VP2蛋白具有一定的免

3、疫原性，但在一些表达系统中仍存在不能诱导中和性抗体或不能兼顾高保护力和避免法氏囊损伤的缺陷，除了病毒抗原漂变的因素，表达产物不能在宿主细胞中正确加工也是一个必须面对的问题。当前发展IBDV重组亚单位疫苗的一大热点，就是候选抗原的表达策略日趋注重于产生更接近天然的抗原结构，如病毒样颗粒（Viruslikeparticles,VLPs）。病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似。表达的IBDV务聚蛋白前体可形成病毒样颗粒，其文献标识码:C形态和大小酷似天然的IBDV病毒粒了。动物免疫实验结果表明,VLPs可以诱导很强的

4、体液免疫，而且通过细胞因子等指标的检测，发现VLPs还可以诱导产生一定程度的细胞免疫。1.1.1昆虫杆状病毒载体表达系统杆状病毒表达系统是90年代发展起来的-种高效表达系统，以杆状病毒为载体在昆虫细胞或幼虫中表达外源蛋白。Martinez-Tor-recuadrada等“发现不同的表达载体在昆虫细胞中表达多聚蛋白可形成不同的形态结构。用这些VLPs免疫动物获得了一定的免疫效果。Vakharia等以杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了IBDV变异株GLS的大片段，免疫SPF后能产生抗病毒中和性抗体,79%免疫鸡可获得保护。Dybing等也证明以重组VP2和VP2/VP4/VP3病毒免疫鸡，能抵抗I

5、BDV标准株STC的攻击，虽然法氏囊仍遭到损害，但攻毒鸡不出现临床症状和死亡。裴建武用杆状病毒作载体在昆虫细胞表达了IBDVCJ-801bkf株VP2cDNA片段，免疫SPF雏鸡可提供部分保护。此外，卢觅佳等以家蚕为生物反应器，首次用家蚕幼虫表达了【BDV多聚蛋白。杆状病毒表达系统虽然具有很多优点，但其本身也有一些缺点，如不能大量培养、繁殖，培养细胞耗时、耗力，对进行工业化生产要求要高。1.1.2噬萌体表面蛋白展示系统T4噬菌体表面蛋白展示系统是利用T4噬菌体表面的两个非必需外壳蛋白SOC和HOC建立起来的，它能同时将两种不同的蛋白分别与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬

6、菌体表面。该系统除了具备其它噬菌体表面展示系统的优点以外，还有容量大、拷贝数高的特点，而且T4噬菌体在宿主细胞内组装而不必通过分泌途径，因此可以展示的多肽或蛋白质范围更广，尤其适合那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质。皆永长等皿用T4噬菌体展示IBDV超强毒株HK46的VP2蛋白获得成功。但由于受噬菌体和大肠杆菌表达的影响，不是所有蛋白都能在噬菌体表面正确装配和折叠。1.2基因疫苗核酸疫苗主要指DNA疫苗，是将病原的保护性抗原基因与载体重组后直接导入动物体内，利用宿主细胞的转录系统合成目的抗原蛋白，诱导宿主对相应的抗原产生免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。山于核酸疫苗具备诱生强细胞免疫应答、

7、成本低、安全性等优点，它在IBDV防治上有潜在的应用空间。匈牙利学者Fodor等首次构建了IBDV-D78株和GP40株的VP2基因及D78株的VP2/VP4/VP3真核表达质粒，免疫SPF鸡后发现含VP2基因的质粒DNA免疫组未能检测到特异性的中和抗体，攻毒不产生保护力，但编码VP2/VP4/VP3质粒能诱导产生免疫反应，仅有55%的免疫鸡产生中和抗体，而攻击强毒的保护率仅达36%,而旦需要大剂量的DNA疫苗（800ug/只）维持免疫反应oHua-ChenChang等也:用pCR3.l-VP2-STC、pCR3.1-VP243-STC和pCR3.1-VP-STC重组质粒免疫鸡,21天攻STC

8、毒株，得到有效的保护，被免疫的鸡感染IBDV后未出现临床症状，抗体检测结果与保护性实验结果一致。国内步志高等:发现IBDVD78株VP?基因免疫能保护超强毒株攻击导致的死亡，但不能阻止临床发病及法氏囊的损伤。与传统疫苗相比，基因疫苗具有制造简单、生产速度快，成本低、容易控制质量、免疫期长、热稳定性好、便于贮藏和运输。基因表达产物虽然相当于亚单位蛋白产物，但由于产物表达于宿主细胞内，可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫，具有弱毒活疫苗的效果，容易制作多价疫苗。此外,利用罪疫苗用基因编码的病原蛋白抗原或抗体建立的诊断方法可以区分DNA疫苗免疫的动物和自然感染的动物。1.3重组活载体疫苗活载体疫苗是

9、含有一种病毒复制基因和另一种病毒免疫原蛋白的杂交病毒，以一些非致病性病毒为我体表达某些病原体的保护性免疫抗原，这种疫苗能真实地再现外源基因编码蛋白的免疫原性，可激发细胞和体液免疫。目前研究较多的活载体疫苗主要是禽痘病毒、禽腺病毒、马立克氏病毒和新城疫病毒载体疫苗等。1.3.1禽痘病毒载体疫苗鸡痘病毒(FPV)是目前所知分子量最大的动物病毒，全长约300Kb,对外源基因的容量最大，并且能够为外源基因的表达提供大最的非必需区，具有良好的开发前景。Shaw等风用禽痘病毒和IBDV-VP2构建重组体fbIBDI,实验证实其保护作用可能是由于细胞介导的免疫所致，且保护作用与鸡的品种有关。Boyle等国构

10、建的重组体rFPV-VP2,接种鸡对澳大利亚分离株002/73有保护作用，但这种保护性与免疫剂量和途径有关。Heine等将IBDV-VP,蛋白与0-半乳糖昔酶融合构建成功的禽痘病毒免疫1和14日龄雏鸡，能抵抗由同源病毒株和其它强毒株造成的死亡，但不能防止法氏囊的感染和损伤。国内金宁一等w在重组鸡痘病毒中表达了1BDVTR'VPr基因，实验证明构建的两个重组质粒在CEF细胞中得到高效表达，但重组疫苗的保护率低于常规疫苗。1.3.2禽腺病毒载体疫苗腺病毒对动物的致病性小，宿主细胞广泛，繁殖后病毒滴度高，腺病毒主要存在于鸟类的眼、上呼吸道及消化道内，但大多数呈隐性或不显性感染，在诱导机体的粘

11、膜免疫中是最为理想的载体之oSheppard等网在禽腺病毒中表达了IBDV-VP?基因，他们将经典毒株002-73的VP2基因插入到禽腺病毒血清型10(FAV-10)载体的非编码区Notl位点，将IB-DV-VP2基因置于禽腺病毒FAV-10的主要后期启动子/引导序列的下游，该重组病毒不缺失任何FAV-10基因组成分。重组病毒经静脉、腹腔、皮下或肌肉接种三周龄SPF鸡，能诱导鸡产生针对IBDV-VP2的抗体，并能保护免疫鸡抵抗经典毒株IBDVV877的攻击，但是经结膜接种的鸡只不能抵抗IBDVV877病毒的攻击。AchilleFrancois等网对表达IBDV-VP2的CEL0重组病毒的免疫保

12、护实验进行了研究，重组病毒通过口服-滴鼻免疫后用IBDV攻击，只产生很低的保护力。1.3.3马立克氏病毒载体疫苗通常认为马立克氏病毒的持续感染和终生带毒的特点不利于用作活载体，但有人认为这也是马立克氏病毒活载体的独特优点，因为它可持续或间歇地刺激动物的免疫系统，以获得长期和坚强的免疫力。此外，病毒的宿主范围窄而专一，作为活载体疫苗具有安全、终生免疫、对抗高滴度母源抗体等优点，且构建的是二联苗，既可抗MDV又可抗IBDV。Tsukamoto等闵构建了表达VP2的重组马立克氏活病毒(rMDV),免疫SPF鸡后获得对同种wIBDV及wMDV攻击的免疫保护率分别为55%和100%。Tsukamoto等

13、:用两种火鸡疱疹病毒重组体rHVT-cmvVP2和rHVT-pecVP2免疫鸡，后者在体外表达的VP?抗原约为前者的4倍，可诱导对致死IBDV毒株的完全保护，而前者只能诱导58%保护。1.3.4新城疫病毒载体疫苗近年来随着对新城疫病毒(NDV)的深入研究，以NDV作为真核表达载体研制多价疫苗的报道也越来越多，并且认为NDV有可能成为新的活疫苗载体oHuangzhuhui等回用新城疫LaSota株表达IBDV变异株GLS-5的VP2基因，动物实验表明该新城疫重组疫苗对NDV和IBDV的攻毒均产生了90%的保护力。由于外源基因插入NDV基因组不同位点对NDV的减毒作用、外源基因表达以及免疫保护性都

14、有显著的影响，因此选择适宜的NDV毒株和适宜的基因插入位点是研制重组NDV活载体疫苗的关键，当然重组NDV对免疫鸡的毒性以及免疫保护效果还需要进一步研究。1.4转基因植物可食疫苗转基因植物可食疫苗是将病原主要保护性抗原基因导入植物形成转基因植物，利用植物作为生物反应器大量表达外源蛋白作为疫苗，或将转基因植物直接加工饲喂动物使其获得免疫。特点是便于大量生产，饲喂方便，适用于粘膜免疫为主的疾病(如IBDV).张丹研究了IBDV-VP2在烟草中的表达情况，证明转基因烟草中产生了能与IBDV特异抗血清反应的IBDV抗原蛋白，为利用转基因植物生产IBDV-VPz可食疫苗提供了实验依据。1.5利用反向遗传

15、技术研制基因工程活疫苗1996年Mundt等涮首次成功建立了IBDV的反向遗传操作系统。IBDV反向遗传学技术允许用体外转录的IBDV完整基因组RNA或携带IBDV全长cDNA的质粒转染细胞重新获得有感染力的1BDV病毒粒子。有些学者在体外对IBDV强毒株或超强毒株的基因组进行改造，获得了毒力减弱的IBDV新毒株。Boot等盥用能表达T7RNA聚合酶的重组鸡痘病毒感染QM5细胞以提供T7RNA聚合酶，然后直接将含基因组全长cDNA的质粒转染QM5细胞,组装出一个新的IBDV病毒子。我国学者曹永长等【叫也用细胞适应株GZ911的A节段和超强毒株LX的B节段组装成了具有CEF感染性的病毒粒子。黄耀

16、伟皿通过反向遗传系统的建立拯救出1B-DV弱毒Xihu2002株。BDV反向遗传学技术的建立，使得人们可以在体外对IBDV基因组进行定向操作，对研究IBDV毒力、抗原性变异和某些结构单元的功能，以及对1BDV基因进行定向改造，获得理想的突变体提供了可靠的手段。2未来发展趋势尽管亚单位疫苗和DNA疫苗均显示了良好的免疫性能，但目前没有一个产品投入商品使用，难以与传统的疫苗相比，成本比较高，缺乏市场竞争力。分析原因主要是：2.1件2蛋白诱导产生免疫保护的能力具有高度的构象依赖性，变性或变性后复性的VP2都不能诱导中和抗体的产生。以多聚体形式存在的VP2有很强的免疫原性，单聚体形式无免疫原性。归2基

17、因无糖基化位点，与此一致的是不同系统表达的VP2产物均在细胞内累积，只有这样的VP2才有免疫反应性或免疫原性，而在VP2上人为加上一段跨膜结构域或分泌信号肽令VP2定位在膜上或分泌出胞外,或者加上糖基，反而降低了VP?的免疫原性吧2.2表达豪统不同，对重组蛋白的表达和加工能力不同，因此可能影响重组产物的结构。一般认为VP?基因编码52KD的产物，经加工后形成41KD的VPCVPX)和37KD的VPa,其中VP2.又是VP?的前体。实际上不同表达体系产生的VP2差异很大，有的只产生"么或VP"有的两者均产生，还有的能检测到52KD产物。造成这种差异的原因除客观实验条件（蛋白电

18、泳技术等）不同外，与所用毒株、表达系统和宿主加工能力有关函。即使同一表达系统表达的VP2蛋白免疫原性效果也并不稳定。2.3VP?基因工程疫苗诱导的免疫应答的类型有限，未能解决抗原变异问题，大部分的基因工程疫苗仅能诱导体液免疫反应，产生的免疫保护力也与诱导中和抗体的高低成正相关。2.4生产成本始终是限制基因工程疫苗产业化的瓶颈，需要细胞培养、蛋白分离、纯化等复杂步骤。因此，多数学者主张IBD基因工程疫苗研究采用无致病性病毒或细菌为载体的活疫苗技术路线。目前以痘病毒、疱疹病毒、沙门氏南减毒株的研究最为深人，经过试验，这些重组体作为疫苗是有效的，兼有活疫苗和亚单位苗的特点，所表达的抗原以半复制的形式

19、提呈给宿主，可成功地诱导各种类型的免疫应答。由于含IBDV-VP2编码基因的重组病毒的免疫保护，主要与所用基因的种类与来源、载体、插入位置、调控基因等有关，而它们则可能通过影响VP?基因尤其是VP2基因表达水平影响到免疫保护，因此，对载体表达系统的选择优为重要。经过多年的探索，目前对载体疫苗的研究应放在如何提高重组活病毒载体的免疫效力上：（1）选用的基因应当是具有优良免疫原性病毒的基因，确定表达系统对表达蛋白进行了正确的折叠和翻译后的加工及修饰；（2）选择适当的外源基因插入部位；（3）提高抗原表达鼠及改变抗原的细胞定位；（4）双载体系统表达1BDV-VP2,使用双载体系统的目的是为了避免在加强

20、免疫时同一载体出现的排斥反应。（5）采用弱毒细菌作为载体，不需要质粒的抽提、纯化，直接口服，方便使用。参考文献1AzadAA,JagadishMN,BrownMA,etal.DeletionmappingandexpressioninEscherichiacoliofthelargegenomicsegmentofabirnavirusJ.Virology,1987,161:145-152.2 JagadishMN,VaughanPR,IrvingRA,etal.Expressionandcharacterizationofinfectiousbursaldiseaseviruspolypro

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