西尼罗河热诊断技术与疫苗研究进展.docx

1、西尼罗河热诊新技术与疫留研充进展刘成倩I李红】易建中毛慈'王捋“陈磊】.2孙晓云微(1上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海2011062上海海洋大学水产与生命学院上海200090)西尼罗河热(WestNileFever,WNF)是由西尼河病毒(WestNileVirus,WNV)引起的一种人畜共患病。WNV属于黄病毒科黄病毒属，为一种单链RNA病毒，经蚊子传播，可引起人类发病，也可引起马、鸟类、猫等动物发病。1937年该病毒在西尼罗河地区的乌干达被发现，因此而得名。此病毒由最初只在非洲地区流行到后来跨越到欧洲、亚洲，直到1999年美国纽约出现人感染事件，引起了世界的广泛关注。2002年此

2、病毒肆虐美洲，约有4000多人在44州遭受感染，284人因此而丧生。在之后的几年陆续有人畜感染的报道，其中2012年有媒体报道在美国的得克萨斯州因蚊虫滋生导致当年夏季的西尼罗河病毒肆虐的趋势加剧，造成15人死亡，上百人感染。当年此病毒在全美国出现了暴发流行，有1590人被感染，66人因此而丧生。到目前为止，已证实WNV存在于非洲、欧洲、美洲、大洋洲和亚洲的多个国家并出现广泛流行，给人类的健康和畜牧业的发展带来了极大的危害。虽然我国还没有西尼罗河病毒的报道，但并不表示我们就是安全的，因为我国的周边国家的部分地区有西尼罗河病毒的出现.所以有必要对我国的鸟类及易感动物进行筛查，并建立一套可行的检测方

3、法。该病毒引起的疾病多为人畜共患病，导致严重的公共卫生问题。本文对西尼罗河热诊断方法及疫苗研究方面进行了综述，为以后研究该病毒提供参考。1西尼罗河热病原学西尼罗河病毒届黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),与昆津病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒等同属于日本脑炎血清群。病毒在电镜下观察呈球形，病毒颗粒直径约4060nm。病毒的核酸为单链RNA,全长11029bp。5,端为I型帽(m7GpppAmp)结构，非编码区有96个核昔酸，基因组编码3个结构蛋白：C(Capsid)蛋白、M(Membrane)蛋白和E(Envelope)蛋白和7个非结构蛋向：NS1、N

4、S2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b及NS5，然后是由631个核昔酸组成的基因组非编码区，3,端无poly(A)尾为CUOH结构。WNV结构蛋白中的C蛋白是一种碱性蛋白，能够结合到病毒基因组。M蛋白为包膜糖蛋白，其-为通讯作者基金项目：上海市科学技术矣员会点科技攻关项目(课赡编号：12391901900)中前膜蛋白(pM)是M蛋白的前体形式。E蛋白为WNV最重要的免疫原性蛋白，是影响病毒亲嗜性及其毒力的主要决定蛋白。根据各地区分离的WNV株E基因片段核甘酸的同源性，将西尼罗河病毒血清型分为血清I型和血清II型。与人类感染有关的是血清I型，流行广泛，并呈世界性分布；而n型主要是非洲的沙哈

5、拉地区和马达加斯加地方性毒株。两血清型之间存在明显的基因变异和抗原变异，引起人类严重疾病的毒株均属于I型。2西尼罗河热流行病学2.1传染源鸟类被认为是西尼罗河热的主要传染源，也是重要的贮存宿主。其中乌鸦、家雀和白头翁等物种极其易感并能携带此病毒。有报道称能从人类、成年鸡、马、驴等动物中分离到该病毒，但它们产生低水平的病毒血症不易成为重要的贮存宿主。也有报道称3种爬虫类(redearslider,gartersnakegreeniguana)和1种两栖类(NorthAmericanbullfrog)也是贮存宿主，但他们自身不发病。俄罗斯的湖蛙有可能是贮存宿主。实验室感染的短吻鳄也是一个贮存宿主。

6、在2012年某期刊上有一则这样的报告，认为蚊子本身可以作为传染源直接传播病毒，并不一定全部是携带病毒的鸟类。2.2 传播媒介蚊子是西尼罗河病毒的主要传播者，尤其库蚊是WNV主要的传播媒介。例如尖音库蚊(CulexPipiens)就是传播WNV的一个重要角色，它通过吸食病鸟血液后再去叮咬人类或者动物，由此将病毒传播开来。除此之外，怀孕、分泌乳汁、输血及职业性接触病毒等都可能导致病毒的传播®。2.3易感动物乌鸦和兰松鸡对WNV特别敏感，马较易感，人也易感。可感染的动物有蝉、花栗鼠、湖蛙、编蝠、鹅、犬、猫、臭鼬、松鼠和家兔等多种动物，但是大多感染后不出现临床症状。3西尼罗河热临床症状不同动

7、物感染WNV的临床症状表现不一。人感染后初期没有明显症状,少数患者会出现发烧、头疼、全身疼痛，少数人患上脑膜脑炎、脊髓灰质炎，甚至死亡。马感染后相当一部分不表现明显的症状，一小部分主要表现为中枢神经系统损伤，主要是嗜睡、食欲废绝、舌头瘫痪、吞咽困难、共济失调、不能站立、肌肉震颤、视觉损伤，有时会表现出过度兴奋或具有攻击性大多数鸟类感染后多死亡，临床症状不明显，有的病例表现为脑炎或长期带毒。4西尼罗河热诊断根据临床症状以及病理变化作出初步诊断，然后通过特异性的病毒学诊断和血清学诊断等进一步确诊。诊断材料可以为动物的组织、脑脊髓液、血清或全血及蚊子"°）。4.1病毒学诊断4.1

8、.1病毒分离鉴定：常用Ver。细胞和兔肾细胞来分离西尼罗河病毒，也可直接从马的脑和脊髓组织，鸟的肾、脑和心脏组织中获得。一般病毒鉴定通过以下3种方法：利用PCR来检测病毒核酸，直接进行病毒中和试验，应用特异性单克隆抗体进行IFA实验。4.1.2病毒核酸检测:RT-PCR技术在RNA病毒核酸检测方面应用前景广阔，可检测脑脊髓液、脑组织中的西尼罗河病毒，此方法特异性很高、检测成本低，但敏感性较差。因此建立敏感性和特异性都很强的套式RT-PCR检测技术用于WNV的检测很有必要。套式RT-PCR方法的特点是需要设计2对引物，然后进行2次PCR,这大大提高了检测的敏感性）。此方法目前已被定为检测马WNV

9、感染的标准方法。随着诊断技术的革新，实时荧光定量:PCR检测技术应运而生。RealtimeRT-PCR方法操作快速简单、灵敏度高、特异性强，是目前检测病毒RNA灵敏度最高的方法，能检测到0.1PFU的病毒RNA。李林海等建立的实时荧光定量PCR检测西尼罗河病毒，具有较高的特异性、敏感性和稳定性，可作为临床诊断WNV的手段（。4.2 血清学诊断所谓血清学检测，通常是指在体外进行的抗原抗体反应，其基本原理就是根据抗原可与相应的抗体特异性结合的特性，利用已知的抗原来检查血清或其它样品如卵黄、牛奶中是否含有相应的抗体.并随着血清学技术的进一步应用，逐渐建立了一些能够利用已知的抗体来捕捉相应抗原的血清学

10、方法。4.2.1普通血清学诊断：血凝抑制试验（HI）主要适用于血清样品，用于抗体的检测。作为样品检测辅助的筛选方法，和ELISA联合使用效果更好。蚀斑减少中和法（PRNT90）由于敏感性和特异性非常高.常用来衡最其它方法所获得的数据的可靠性，因次被视为WNV感染血清学检测的“黄金法则”。但是实验周期较长（58）d,实验技术要求较高，需在3级生物安全柜操作，且比较繁琐，不适合普及（。4.2.2ELISA检测方法：目前西尼罗河病毒抗体检测的主要方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）,此法方便快捷、重复性好，适用于大规模的病毒抗体筛查。（1）间接ELISA。间接ELISA法建立的时间比较早，常被用于检

11、测和诊断。它的优点是只要变换包被抗原，就可以利用同一酶标抗抗体来建立检测相应抗体的方法。Beasley等'利用表达的重组E蛋白作为检测的间接ELISA抗原，证明了该重组蛋白可作为WNV感染的血清鉴别检测的依据。杜冬菊等'体外表达了重组E蛋白结构域皿，优化了间接ELISA反应条件，建立了西尼罗河病毒抗体的间接ELISA检测体系。检测时不论是野生的病毒抗原还是纯化的重组蛋白，都要求抗原的纯度一定要高，否则会增强反应的背景。（2）IgM抗体捕获ELISA（MAC-ELISA）。MAC-ELISA方法操作要求较低，应用广泛，是最有效的检测方法。IgM抗体是血清中最早出现的抗体，常用于检

12、测感染后814d的血清或脑脊液样品。用于检测马血清时，其敏感度为91%,特异性为99%。Tardei等河在做MAC-ELISA检测时发现脑脊液中出现特异性体液免疫反应的时间要早于外周血。Porter等s在做WNVMAC-ELISA检测时发现用马的脑脊液与用血清的检测结果一致，而且脑脊液的非特异性反应比血清少。因此用MAC-ELISA做WNV早期诊断时可以优先选择脑脊液。目前MAC-ELISA方法由于其检测的高特异性和高敏感性而被广泛应用。但是MAC-ELISA也有缺点,检测过早会出现假阳性结果，所以经MAC-ELISA筛查的阳性样品还需用蚀斑减少中和试验进行验证。（3）抗原表位阻断ELISA。

13、抗原表位阻断ELISA（bELISA）利用的是WNV血清中特定抗原表位的抗体与此抗原表位的单克隆抗体的竞争性结合的强弱来判断WNV血清中该抗体的浓度。由于只涉及到1个表位、1株抗体，因此可以很好地控制交叉反应。WNV感染多种鸟类、家禽及哺乳动物，而本方法可以只选择一种二抗，就可以完成，简单、方便、快捷。HoldenP等成为了区分默里谷脑炎病毒和WNV的亚型病毒昆津病毒的特异性血清，就是利用NS1±面的抗原表位阻断进行的。由于表位阻断ELISA针对的是非中和表位，因此其检测结果比PRNT结果的阳性率高。WNV感染中有少量NS1蛋白的分泌，能激发产生高滴度的抗体，因此利用重组表达并纯化获

14、得的病毒特异性抗原用于血清学检测。5西尼罗河热疫苗目前西尼罗河热疫苗取得了重大进展，多种疫苗正处于临床试验阶段。以下是近年来报道的新型西尼罗河热疫苗。5.1嵌合减毒疫苗ChimeriVax-西尼罗河热疫苗是一种基因设计的减毒活疫苗，是在已有的抗黄热病疫苗的基础上修改成了西尼罗热疫苗。第一个完全】期的临床试验结果显示此疫苗是安全的，几乎所有参试者都产生了中和病原物的抗体。5.2 DNA疫苗背靠背的西尼罗河病毒疫苗是DNA疫苗设计中的一种聪明扭曲，它能提高模式动物对登革热病毒和西尼罗河病毒的防御力。含有这种背对背DNA疫苗的细胞首先会像传统DNA疫苗一样刺激免疫系统，但不会生产具有感染的活病毒。然

15、而，因为只有产生于一个方向上的外壳蛋白能包裹西尼罗河病毒的基因组，而产生于相反方向序列的其他蛋白质只能生产其他新类型的病毒，并感染相邻细胞，这样就大大促进了免疫系统。在对小鼠和马的试验中，这种疫苗已显示出对西尼罗河病毒的防御力m)；pKUNdC/C是一种基因疫苗，它的优越性在于疫苗纯度高、无杂质，安全性好，并且相对于其他传统型的疫苗如致弱的活病毒苗来说，该DNA疫苗十分稳定。5.3 单克隆抗体单克隆抗体能治疗西尼罗河病毒感染。Oliphant等)发现了一种大鼠单克隆抗体(E16),它在体外试验中可以中和WNV的10种不同毒株，并且在1个WNV感染的大鼠模型中表现出显著的治疗效果。E16抗体已经

16、被克隆，并且作为治疗人类WNV感染的可选药物。6西尼罗河热的预防与治疗目前我国还没有关于西尼罗河热病的报道，但这并不是说我国就是绝对安全的，WNV潜在的宿主鸟类和可能的传播媒介蚊子在我国是存在的，而且迁徙鸟也可能把WNV从发病地区携带到我国，所以做好西尼罗河热病的预防工作是很有必要的。蚊子是WNV的主要传播媒介，WNV流行与蚊子活动密切相关。因此定期灭蚊，减少人群接触蚊子及被蚊子叮咬的概率是控制西尼罗河热病流行的基本措施。参考文献IJSmithBurnKC*HughesTP,BurkeA,elal.Aneurotropicvirusisolatedfromthebloodofanativeof

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