马流感疫苗研究进展.docx

1、Vol.35,No.7Jul.2013中国预防善医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicinedoi:10.3969/j.issn,1008-0589.2013.07.22马流感疫苗研究进展刘春国I,刘飞2,彭永刚I,刘明L相文华卜(1.中国农业科学院呛尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室.黑龙江哈尔滨150001;2.中国农业科学院上海兽践研究所，上海200241)中图分类号：S852.65文献标识码：B文章编号：1008-0589(2013)07-0599-04收稿日期：2011-10-17基金项目：公益性行业(农业)科研专项(2010

2、03075)作者简介：刘春国(1978-),男，湖南茶陵人，博士，助理研究员，主要从事动物流感病毒分子生物学及免疫学研究.'通信作者：E-mail：liuming04；xiangwenhual马流感(Equineinfluenza,EI)是由正黏病密科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equineinfluenzavirus,EIV)引起的马属动物一种严重的上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播迅速而且范围广泛。O1E规定马流感为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。1956年Sovinova等在布拉格首次分离到H7N7亚型EIV,1963年Waddell等在

3、美国分离到一株H3N8亚型EIV，随后许多国家和地区相继暴发EI疫悄。迄今为止H7N7亚型EI已有20多年未曾报道，一般认为该型病毒已从自然界中消失，因此目前的EI疫苗研究逐步将该亚型病毒淡出计划外。从1987年起，H3N8亚型EIV开始分化为欧洲谱系和美洲谱系。在进化过程中美洲谱系病毒进一步进化成3个分支：即南美分支、肯塔基分支和佛罗里达分支。而欧洲谱系病毒受宿主免疫选择压力较小，因此遗传变异比美洲谱系病毒相对缓慢，至今尚无进一步分化的趋势。近年来，H3N8亚型美洲型EIV在各种压力下正在快速变异，甚至突破种间屏障感染犬和猪【7,造成了严重的经济损失。当前疫苗接种是控制EI的有效策略时。然而

4、，当前的EI疫苗对EI的防控并不完全有效，在EI疫苗免疫的马群中也常暴发系统发育分析揭示HA抗原飘移是导致疫苗免疫失败的主要原因。除此之外，疫苗的种类、佐剂的选择以及免疫接种方式也是影响疫苗免疫效果的重要因素。当前商品化的以及正在研制的EI疫苗有传统的灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗以及DNA疫苗等种类。本文对当前EI疫苗研究进行简要的综述，并介绍我国在EI疫苗研制方面所做的工作。1灭活疫苗目前世界上大多数国家采用EI灭活苗来防控EL一般选用具有代表意义的H7N7亚型和H3N8亚型EIV制成二价苗或多价苗，并根据病毒分子流行病学的研究，针对本国实际情况，选取流行代表病毒株制成

5、疫苗W。)。灭活疫苗安全性好，免疫原性强.不会存在毒力返强和变异的危险。EI灭活疫苗首先于20世纪60年代研制成功，接种马后能够提供有效的临床保护传统的灭活EI疫苗通常采用铝胶作为佐剂，这种疫苗诱导产生的抗体持续时间比较短，在目前的免疫程序下，二免和三免之间会存在一个免疫空白期.不能够提供充分的保护，容易受到EIV的攻击。辅以CpG和Emulsigen佐剂的EI疫苗(EncevacTC4,IntervetInc.)比没有添加佐剂的疫苗显著提高血清学反应皿。使用高分子胶佐剂的EI疫苗比铝胶佐剂疫苗能够诱导更高水平的和更长期的抗体反应。EquilisPrcquenzaTe疫苗选用第二代免疫剌激复合

6、物(Immune-stimulatingcomplex,ISCOM)作为佐剂，二免5个月后仍能够提供保护.减少临床症状和排毒以及发热，并对怀孕雌马和幼驹均安全有效网。ISCOM-EI疫苗(EQUIPF)肌肉接种后能够诱导产生抗EIV的特异性免疫反应.并且上调IFN-7的表达，二免后攻毒，免疫马表现出非常少的疾病症状并且没有病毒排出"气笔者利用反向遗传学技术将我国优势流行株Aquine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA和NA基因与PR8的内部基因进行重排.成功构建出低毒高产的重蛆疫苗毒rH3N8-PR,将其灭活后用法国SEPPIC公司生产的MONTANIDEPETGEL

7、A佐剂进行乳化，免疫后能够诱导所有马在短时间内产生血凝抑制抗体和中和抗体，亲本毒株攻毒后马不发病，不排毒.能够提供100%的保护网。EI灭活疫苗不能够诱导有效的长期的免疫保护，需要多次免疫，而且副反应比较多，如EI疫苗接种后导致接种位点发生严重的纤维肉瘤照。而E1V自然感染后能够诱导长期的免疫保护，进一步研究发现马自然感染后产生了黏膜IgA与血清IgGa和IgGb,而传统的灭活疫苗只产生血清IgG(T)。灭活疫苗和病毒自然感染所诱导的免疫反应的差异表明疫苗的设计还有被提升的空间。开发模拟自然感染所诱导的长期免疫保护的疫苗具有重要的意义。2弱毒活疫苗弱毒疫苗的经典制备方法是连续传代致弱，即将病毒

8、在含有正常马血清的鸡胚尿囊腔中连续继代致弱。弱毒疫苗鼻内接种马，能够诱导良好的免疫保护。Youngner等通过逐步降低温度的方式将EIV在鸡胚中进行连续传代，筛选到一株稳定的冷适应温敏感突变疫苗株，鼻内接种不会引起不良反应和明显的临床症状，仅在呼吸道上部夏制.并能够诱导强烈的血清IgGa和IgGb抗体反应，一个剂量免疫后就能够提供三个月的临床保护，该疫苗已经在北美上市四。Chambers等构建了具有安全、稳定和低传播特性的冷适应活疫苗FluAvertI.N.,实验证明该疫苗，一免6个月后攻毒，可以减少临床症状的严重程度和持续期，能够对EI野毒株的攻击提供有效保护叫Quinlivan和Breat

9、hnach等利用反向遗传学技术构建了NS1蛋白C末端截短的EIV突变株，该突变株在体外削弱了抑制IFN产生的能力，并且与亲本株相比，突变株在鸡胚、MDCK细胞或鼠模型中不能够有效复制。因此，致弱的NS1突变株有潜力作为EI活疫苗候选株【心七弱毒疫苗免疫后诱导典型的黏膜IgA与血清IgGa和IgGb抗体反应，能够模拟自然感染诱导产生体液、黏膜和细胞免疫反应，发挥良好的免疫保护效果，然而弱毒疫苗的安全性问题一直是其难以突破的瓶颈，而重组病毒活载体疫苗则不失为一个好的选择。3重组活载体疫苗重组痘病毒载体可以在宿主细胞中表达外源蛋白，并将其以与自然感染相似的途径提呈给免疫系统，因此广泛用于多种疫苗的研

10、制。以修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)作为栽体制备的EI疫苗能够刺激EIV特异性抗体的产生，并上调IFNr的表达，攻毒后能够提供良好的保护效果，不出现临床症状，不排毒叫。2003年，EI金丝雀痘病毒活载体疫苗(Proteq-Flul,Merial)在欧盟得到许可用于马的免疫，单次免疫就能够刺激产生体液免疫反应，并且攻毒后能够保护马不产生临床症状，不排毒。Paillot也构建了包含上述两种抗原的重组金丝雀活载体疫苗，通过了美国农业部的认证。Sobol等用ALVAC重组活载体疫苗(金丝雀痘病毒载体表达上述两种病毒的HA蛋白)免疫马，能够诱导抗体产生较早，并能够持续6个月对同型EIV产生免疫保护

11、皿。Minke等构建了重组金丝雀痘病毒载体EI疫苗(rCP-EIV疫苗)，二免5个月后仍能够提供保护，表明该疫苗避免了传统灭活疫苗二免和三免之间的免疫空白期凹。1型马疱疹病毒和EIV都是马呼吸道疾病的重要病原，将两者联合起来制成疫苗将有良好的应用前景。将EIVHA基因插入到1型马疱疹病毒中，免疫后能够诱导长期持久的抗EIV和1型马疱疹病毒的抗体反应网。笔者以人5型复制缺陷型腺病毒为载体成功构建了重组EIVHA基因的重组腺病毒。小鼠模型实验结果表明，该疫苗能够对亲本病毒的攻击提供完全保护，并有效清除病毒在小鼠体内的复制。马体实验果表明该疫苗以10sTCID«的剂量一次免疫即能够诱导所有

12、马产生中和抗体(叫4亚单位疫苗目前EI亚单位疫苗的研究相对较少，Olsen等通过杆状病毒表达EIVHA蛋白，鼻内免疫BALB/c小鼠能够诱导产生病毒特异性抗体，但不具有中和活性，仅能够对病毒攻击提供部分保护。笔者利用杆状病毒表达系统成功双表达了EIVHA和Ml蛋白，并成功装配成病毒样颗粒.将其以不同剂量免疫BALB/c小鼠，不仅能蝶诱导病毒特异性血凝抑制抗体产生，而且还能够诱导产生中和抗体，能够对亲本病毒的攻击提供100%的保护四。鉴于亚单位疫苗在人和动物多种疾病的研究中已经取得成功，因此我们有信心成功研制EI亚单位疫苗。5DNA疫苗DNA疫苗是第三代疫苗，因其能够诱导与自然感染相似的免疫反应

13、，所以可以替换传统疫苗。小鼠、雪貂、鸡及灵长类动物等的免疫实验已经证明DNA疫苗对于抵抗流感病毒感染是有效的。Olsen等将编码EIVHA蛋白的质粒DNA免疫BALB/c小鼠不仅能够诱导病毒特异性ELISA抗体，还能够诱导产生中和抗体。首免后3周进行加强免疫，与对照鼠相比免疫组能够更快速的清除感染，但不能够产生保护；而首免9周后加强免疫，可产生90%的完全保护凶2%Lunn和Soboil等将含有EIVHA基因的DNA疫苗免疫马，黏膜免疫能够提供完全保护，不产生临床症状，而皮肤接种只能提供部分保护（加七6我国马流感疫苗的研究概况70年代，我国曾研制过3种EI灭活疫苗：H7N7亚型单价苗（疫苗株为

14、京防-74株）、H3N8亚型单苗（疫苗株为美国迈阿密63株）和EI联苗，但这些疫苗都没有大面积应用，而且早已不用，一旦EI发生后，主要采取一些对症治疗措施。目前我国尚没有具有自主知识产权的商品化EI疫苗，所用疫苗都依赖于国外引进，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-FluU在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI.我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。然而国外进口疫苗价格不但昂贵，而且不能够对我国EIV流行株的攻击提供有效的临床保护四。基于上述存在的问题.哈尔滨兽医研究所马病专家相文华研究员领导的马病课题组对我国EI的血清学、病原学和分子生物学开

15、展了普查与监测，在了解了EI在我国的流行分布情况以及我国EIV抗原和遗传变异规律的基础上，筛选出我国具有代表性EIV疫苗参考株.利用传统的经典方法制备了灭活疫苗.试验表明该疫苗能够诱导良好的免疫保护。同时刘春国等开展了利用反向遗传学技术构建适应鸡胚和细胞的高产疫苗株，动物试验结果表明该疫苗能够对病毒攻击提供完全保护网。考虑到灭活疫苗的缺点和重蛆活载体疫苗的优势，该课题组在研究灭活疫苗的同时也进行了重组活载体疫苗的研究.如重组旗痘病毒活载体疫苗、重蛆腺病毒活载体疫苗四和甲病毒复制子疫苗，另外也开展了DNA疫苗、冷适应活疫苗和亚郎位疫苗的研究。相关研究已取得了阶段性研究成果，并申请了专利。这些工作

16、为研制符合我国国情的拥有我国自主知识产权的EI疫苗奠定了基础，为我国EI的防控提供理论基础和技术储备，同时也填补了我国E【疫苗研究的空白。7结语马术比赛的蓬勃兴起凸显了马作为娱乐动物的重要性。近年来马术比赛在我国也正逐渐兴起，多项国际马术赛事在我国举行，不可避免马匹在国际以及国内间的流动，由于国外EI疫情的不断暴发，增加了我国E1疫情发生的风险。而且我国马匹基本不进行疫苗免疫，更增加了我国EI发生的隐患。另外，由于EIV的抗原漂移或转变，原有疫苗往往不能提供良好的保护，这也是E1防制过程中需要克服的主要矛盾。包括0IE和WHO在内的EI专家调查委员会每年都会对EI暴发的信息以及分离株的特性做以

17、详细的记录和分析，并推荐更合适的疫苗株。然而不同国家的流行病学监测水平以及病毒搜集的差异导致关于优势流行病毒的信息有所差异。这就有必要进行全球性的流行病学监测以及增加人们对疫苗更新所带来的利益达到充分的认识。就我国目前的状况而言也迫切需要建立完善的EI监测体系，相关部门紧密通力协作，及时筛选更新符合我国国情的EI疫苗株，并利用先进的技术开展多种不同类型疫苗的研究，为我国的EI防控保驾护航。参考文献：1 WaddellGH,TeiglandMB,SigelMM.AnewinfluenzavirusassociatedwithequinerespiratorydiseaseJ.JAmVetMedA

18、ssoc,1963,143:587-590.2 HinshawVS,NaeveCW,WebsterRG,etal.Analysisofantigenicvariationinequine2influenzaAvirusesJ.BullWorldHealthOrgan,1983,61(1):153-158.3 LaiAC,ChambersTM,HollandRE,etal.Divergedevolutionofrecentequine-2influenza(H3N8)virusesintheWesternHemisphereJ,ArchVirol,2001,146(6):1063-1074.4

19、CrawfordPC,DuboviEJ,CastlemanWL,etal.Transmissionofequineinfluenzavirustodogs(Jj.Science,2005,310:482-485.5 TuJia-gang,ZhouHong-bo,JiangTao-zhen,etal.IsolationandmolecularcharacterizationofequineH3N8influenzavirusesfrompigsinChinaJ.ArchVirol,2009,!54:887-890.6 MorleyPS,TownsendHG,BogdanJR,etal.Effic

20、acyofacommercialvaccineforpreventingdiseasecausedbyinfluenzavirusinfectioninhorses(J.JAmVetMedAssoc,1999,215(I) :61-66.7 YamanakaT,NiwaH,TsujimuraK,etal.2008.EpidemicofequineinfluenzaamongvaccinatedracehorsesinJapanin2007J.JVetMedSci,70:623025.8 YatesPJ,MumfordJA.Equineinfluenzavaccineefficacy:thesi

21、gnificanceofantigenicvariationJ.VetMicrobiol,2000,74:173-177.9 KuceraCJ,BcckcnhauerWH.Studiesontheantigenicityofaninactivated,aluminumhydroxideadjuvantequineinfluenzavaccineJ.CanJCompMed,1977.41(3):326-331.10 PaillotR,ProwscL,DonaldC,etal.EfficacyofawholeinactivatedEIvaccineagainstarecentEIVoutbreak

22、isolateandcomparativedetectionofvirussheddingJ.VetImmunolImmuno-pathol,2010,136(3-4):272-283.11 HcidcnsJG,PouwelsHG,vanLoonAA.EfficacyanddurationofimmunityofacombinedequineinfluenzaandequineherpesvirusvaccineagainstchallengewithanAmcrican-likeequineinfluenzavirus(A/cqui-2/Kentucky/95)J.VetJ,2004,167

23、(2):150-157.12 LopezAM,HeckerR,MutwiriG,etal.FormulationwithCpGODNenhancesantibodyresponsestoanequineinfluenzavirusvaccineJ.VetImmunolImmunopathol,2006,114(1-2):103-110.13 HeldensJG,PouwelsHG,DerksCG,etal.ThefirstsafeinactivatedequineinfluenzavaccineformulationadjuvantedwithISCOM-Matrixthatclosesthe

24、immunitygapJ.Vaccine,2009,27(40):5530-5537.1句PailiotR,GrimmettH,EltonD,etal.Protection,systemicIFNgamma,andantibodyresponsesinducedbyanISCOM-basedvaccineagainstarecentequineinfluenzavimsinitsnaturalhostJJ.VetRes,2008,39(3):21.15 刘春国.20102011年中国H3N8亚型EIVHA基因遗传演化分折及不同类型疫苗的初步研究DJ.北京：中国农业科学院，2012.16 Kan

25、negieterNJ,SchaafKL,LovellDK,ctal.Myofibroblas*ticfibrosarcomawithmultifocalosseousmetaplasiaatthesiteofequineinfluenzavaccinationJ.AustVetJ,2010,88(4):132-136.17 YoungnerJS,Whitaker-DowlingP,ChambersTM,etal.Derivationandcharacterizationofaliveattenuatedequineinfluenzavaccinevirus(J).AmJVetRes,2001,

26、62(8):1290-1294.18 ChambersTM,HollandRE,TudorLR,etal.Anewmodifiedliveequineinfluenzavirusvaccine:phenotypicstability,restrictedspreadandefficacyagainstheterologousviruschallengeJ.EquineVetJ,2001,33(7):630-636.19 ChambersTM,QuinlivanM,SturgillT,eta(.InfluenzaAviruseswithtruncatedNS1asmodifiedliveviru

27、svaccines:pilotstudiesofsafetyandefficacyinhorsesJJ.EquineVetJ,2009,41(1):87-92,QuinlivanM,ZamarinD,Garela-SastrcA,etal.AttenuationofequineinfluenzavirusesthroughtruncationsoftheNS1protein(JJ.JVirol,2005,79(13):8431-8439.20 BreathnachCC,ClarkHJ,ClarkRC,etal.Immunizationwithrecombinantmodifiedvaccini

28、aAnkara(rMVA)constructsencodingtheHAorNPgeneprotectsponiesfromequineinfluenzaviruschallengeJ.Vaccine,2006,24(8):1180-1190.21 BreathnachCC,RudcrsdorfR,LunnDP.UseofrecombinantmodifiedvacciniaAnkaraviralvectorsfbrequineinfluenzavaccinationJ.VetInununolImmunopathol,2004,98(3-4):127-136.22 PailiotR,KyddJ

29、H,SindleT,ctal.AntibodyandIFN-gammaresponsesinducedbyarecombinantcanarypoxvaccineandchallengeinfectionwithequineinfluenzavirusJ.VetImmunolIm-munopathoi,2006,112(3-4):225-233.23 SoboilG,HusseySB,MinkeJM,etal.Onsetanddurationofimmunitytoequineinfluenzavirusresultingfromcanarypox-vec-tored(ALVAC)vaccinationJ.VetImmunolJmmunopathol,2010,135(1-2):100-107.24 MinkeJM,TouiemondeCE,CoupierH,ctal.Efficacyofacanarypox-vectorcdrecombinantvaccineexpressingthehemagglutiningeneofequineinfluenzaH3N8virusintheprotectionofponiesfromviralchallengeJ.AmJVetRes,2007,68(2):213-219.25 VandeWalleGR,May