表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建.docx

1、表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建孙强强I刘忠琛七胡潘七左青山2,吴美芹I,马晶*李明义2，单虎'(1.青岛农业大学，山东青岛266109;2.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛266032;3.胶州市畜牧善医局，山东胶州266360)摘要：利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK.根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物，PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完备的基因表达盒插入puDTK的TK上，获得质粒puDTCL。根据Gen

2、bank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列，设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因，克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间，成功构建合LacZ及HA基因的转移载体质puDTCL-HA.将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传姓状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒.关键词:禽流感病毒;鸭瘟病毒;TK基因；H.A基因；重组鸭瘟病毒中图分类号：S852.659.5文献标识码:A文章编号:1005-944X(2009)04-0040-04ConstructionofRecombinantDuckPlagu

3、eVirusEjqnessingHAGeneofH5N1SubtypeAvianbifhienzaVirusSunQiang-qiang'LiuZhong-chenHuXiao2,ZuoQing-shan'WuMei-qin1,MaJing',LiMing-yi2,ShanHu1(1.QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109：2.QingdaoYebioBioengineeringCompany,Qingdao266032;3JiaozhouAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Jiaozho

4、u266360)Abstract：UsingextractedtotalDNAfromduckplaguevirus(DPV)astemplate,the2.5kbTKgenenonessentialforviralreplicationwereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andclonedintopUC19vecteratonetimetoobtainpuDTK.AccordingthepcDNA-LacZsequence,onepairsoftheprimersusedtoamplifyCMV,itsintegralitygenecase,

5、SV40andLacZwhichlieintheplasmidpcDNA-LacZwereinsertedintoTKsitewhichliesinpuDTK.,resultinginthetransfervectorpUTCL.OnepairofprimerswassynthesizedaccordingHAsequenceofH5N1subtypeavianinfluenzaviruspublishedongenebank,whichwasusedtoamplifyHAgenefromT-HA,thenwasinsertedintotheresultingtransfervectorpUT

6、CLinthemulticlonalsitestoobtainthepUTCL-HAvectorcompletely.Afterconstructionoftransfervector,itwastransfectedonCEFcellswithDPV.Followingdonningandpurificationofblueplaque,thepureHA-fbwlpoxvirusrecombinantwasobtained.KeyWords:Avianinfluenzavirus;Duckplaguevirus;HAgene;TKgene;rDPV禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的一种禽

7、类的急性、烈性接触性、呼传染病。通常情况下，禽流感病毒并不感染人类，但自1997年禽A型流感病毒H5N1感染人类之后，相继有H9N2.H7N7亚型感染人类和H5N1再次感染人类的报道，引起世人广泛关注®叱对高致病性禽流感(HPAD的控制主要采用隔离封锁疫点、扑杀销毁感染动物以及疫苗免疫相结合的方式，但是在疫情波及范围很大，扑杀感染动物很难实施时，用疫苗免疫控制疫情是不可替代的措资助项目：863项目.(家禽重妄病*病基因工程疫苗研究和创新，2006AA10A205)通讯作者：李明义施。近年来，高致病性禽流感对于鸭、鹅等水禽的感染病例逐渐增多，致病性也逐渐加强，而且水禽也是禽流感病毒重要

8、的携带和储藏宿主，在高致病性禽流感病毒的变异和传播过程中扮演重要的角色。因此，水禽免疫是高致病性禽流感防制的关键环节。对HPAI的控制主要采用隔离封锁疫点、扑杀销毁感染动物和受威胁动物以及其它生物安全措施，但是在疫情波及范围很大，扑杀感染动物很难实施时，用疫苗免疫控制疫情则是不可替代的措施。鸭、鹅等水禽是禽流感病毒重要的携带和储藏宿主，在高致病力禽流感病毒的变异和传播过程中扮演极为重要的角色，因此，水禽免疫是高致病性禽流感防制的关健环节。但目前已投入使用的各种流感疫苗对于水禽抗原性差、免疫效果不确实等缺点。因此，急需构建一种适用于水禽的以鸭瘟病毒为载体新型重组病毒疫苗。血凝素HA是禽流感病毒(

9、A1V)具有免疫保护性的主要蛋白,HA是用来做重组禽流感病毒疫苗的首选抗原。鸭瘟(DP)又称鸭病毒性肠炎(DVE),是常见于鸭、鹅、天鹅等雁行目禽类的一种急性、高度接触性传染病，是目前对世界范围水禽养殖业危害最严重的疫病之一。预防鸭瘟的传统疫苗有灭活苗和弱毒苗，其中DPV34F2株是DPV经典的弱毒株，是国内沿用多年的优度弱密疫苗株，在鸭瘟病的防治中发挥了重要作用阪)。但DPV34F2株也有不足之处，即它为TK+表型，有神经毒力，可引起潜伏感染。TK基因是DPV的主要毒力基因，同时也是病毒复制的非必需基因，鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守，为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体

10、奠定了基础，TK表型的DPV变异株在神经细胞中的复制能力则大为减弱，故TK基因为构建DPV基因缺失疫苗的首选靶基因。因此，以DPV34F2株作亲本病毒fKTK基因缺失区插入禽流感病毒的IIA基因构建重组活载体疫苗株，这在理论和实践上均是可行的。本文构建了含LacZ报告基因与HA的IL24-TK基因的转移质粒载体，与DPV同源重组，获得了表达HA蚩白的重组DPV,为进一步研究表达HA蛋白的rDPV的免疫学特性奠定了基础。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，rTaq酸，T4DNA连接酶，pUC19载体，限制性内切酶EcoRLHindlll,BgllbNheLApa

11、l等均购自宝生物工程有限公司；牛小肠碱性磷酸酶购自Promega公司；DMEM干粉购自GIBCO公司，犊牛血清购自杭州四青生物工程公司产品，批号:200010303o其他试剂均为国产分析纯。1.1.2质粒、菌种与毒株DPV34F2疫苗株购自黑龙江省生物制品一厂；大肠杆菌转化胸株DH5a,及含有HA基因的T-HA质粒均由本室保存：质粒pcDNA-LacZ由本室实验人员构建:SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司。1.2方法1.2.1病毒DNA的提取及同源臂的PCR扩增感染DPV34E2株的CEF细胞总DNA提取，参考魏荣方法进行。将上述提取的感染DPV34F2株的CEF细胞的总DNA为PCR扩增的模板

12、，根据Genbank己发表的DPV基因序列，合成两对引物，在UL24-TK基因中间位置引入酶切位点BglII,为后序实验做准备。UL24-TK1-Hindlll-U:5z-ATAAAGCTTAATGCACTAGTGTTTAG-3，UL24-TKl-BglII-L:5,-TATAGATCTGGTGGTGTTCTTTCTG-3,TK2-BglII-U：5'-AATAGATCTTACGCTCATAAHG-3TK2-EcoRI-L：5z-TATGAATTCTACCTGGGACAGAA-3*用上述UL24-TK1-对引物扩增出左同源臂LL24-TK1,扩增长度为1500bpoPCR反应的条件为：

13、94C预变性5min,94C变性30s,57C退火30s,72C延伸1.5min,30个循环，最后72C延伸lOmin。用上述TK2的对引物扩增出右同源臂TK2,扩增长度为lOOObpoPCR反应的条件为：94C预变性5min,94*C变性30s,53C退火30s,72*C延伸lmin,30个循环，最后72C延伸10min<»1.2.2含UL24-TK同源臂基因puDTK质粒的构建将回收的PCR产物直接用相应引物两端设计好的限制性内切酶处理，与用HindHI和EcoRI处理PUC19载体进行三片段连接，所获得的至组我体质粒命名为puDTK,酶切鉴定正确后送上海基因公司测序。1.

14、2.3含CMV启动子、LacZ报告基因的基因表达盒质粒puDTCL的构建根据pcDNA-LacZ的序列设计一对引物含有BgHI的酶切位点，从质粒pcDNA-LacZ上PCR扩增出含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒基因片段，将回收的PCR产物用Bglll处理后克隆到经Bglll的酶消化的质粒pGTK的TK上，获得载体质粒puDTCLo1.2.4含LacZ报告基因与I1A基因目的片段的转移载体质粒puDTCL-llA的构建根据Genbank己发表的HA基因序列设计一对引物：HA5-Nhe-u:5/-TTAGCTAGCATGAAGAAAAT-3'HA5-Apal

15、-L:5'-ATTGGGCCCTTAAATGCAAA-3，以T-HA质粒为模板PCR扩增HA基因，克隆到质粒pGTK-EGFP的多克隆位点Nhel和Apal之间，获得质粒puDTCL-HA.1.2.5转移载体的构建过程（图1）。1.2.6重组转移载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染取生长良好的原代CEF单层细胞经胰防消化后，调整细胞密度以达到毫升30-50万个细胞，然后分装细胞到六孔板，待细胞生K至70%-80%即可进行感染和转染。感染病毒量为200PFU,同时加入2.5ug转染质粒及9ulMirus转染试剂，按试剂盒说明书进行操作,30min后加入10%胎牛血清的DMEM,5%CO2

16、,37,C培养4-5d出现病变（蚀斑），利用浓度为0.3mg/mlX-gal的DMEM琼脂铺胶显M：DL-2000Marker;A：UL24-TK2基因PCR产物；B：TK2因PCR产物图2同源曾基因片段PCR扩增结果增产物HA;B：DPV34F2林未扩增出HA的目的条带图5重组DPV的PCR鉴定色后,在显微镜下挑取蓝斑，至0.2ml无血清DMEM的离心管中，用以筛选。1.2.7重组病毒的筛选与鉴定将挑取的蓝斑反复冻融3次，利用超声波将病毒释放。用无血清DMEM稀释重组病毒成10-M010-3稀释度,取015ml/孔接种原代或传代CEF单层细胞，置5%02,37*0培养2h,用含1%低融点琼脂

17、耕的DMEM于5%CQ的37C培养直至细胞出现蚀斑，再用0.3mg/mlX-gal的DMEM琼脂显色,370培养24h,挑取较高稀释度蓝斑或周围无白斑的蓝斑放入0.2ml无血清的DMEM离心管中，冻融三次后再重复以上步骤，直至每一个病毒蚀斑均为蓝色，提取重组基因组DNA,做PCR鉴定。1.2.8重组病毒HA基因表达产物Western-blot鉴定bpMABisoooflBHHHH75005000250nmM：DL-15000Marker;A：表达会基因PCR产物；B：HA基因PCR产物图3表达盒基因、HA基因片段PCR扩增结果M为Marker;A：HA|l达产物图6重组病毒Western-bl

18、ot鉴定培果在重组鸭瘟病毒和亲本鸭瘟病毒感染的CEF细胞出现100%CPE时收获，用PBS（pH7.4）洗三遍，加入适量预热的2XSDS电泳缓冲液裂解细胞，收集到一微量离心管中，置于沸水中煮沸Imin使蛋白样品充分变性，阳性对照（禽流感病毒）样品的制备过程同上。按分子克隆所述进行灌胶叫待聚合后进行凝胶电泳，结束后将凝胶置于转印装置，用于Western-blot鉴定，通过检测HA糖蛋白来确定外源基因是否具有活性。2结果2.1PCR扩增结果2.1.1PCR扩增同源臂UL24-TK1基因和TK2基因,产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可分别约为1500bp和lOOObp的特异性条带，与预期的条带位置相符（图

19、2）。bpMlM2ABC颇MHPWVMMl:DL-15000Marker;M2：DL-2000Marker;A：史姐质粒Knpl单*切整定；B：史处质liHindlll单#切饕定；C：费姐术拉PCR扩增的HA基因图4puDTCL-HA的PCR及酶切鉴定结果2.1.2PCR扩增含CMV启动了、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒和HA基因，产物经1%琼脂糖电泳，可见分别约为5200bp和1700bp的特异性条带，与预期结果一致（见图3）。2.2重组转移载体质粒的PCR及酶切鉴定以重组质粒PuDTCL-HA为模板，可扩增出大小约为1700bp的HA基因目的条帝；将重组阳性质粒puDT-

20、CL-HA分别用Knpl和Hindlll酶切鉴定，Knpl切出的三条带约为419bp、682bp和10956bp;HindiII切出的两条带约为4015bp和8042bp,电泳结果与分析一致（见图4）。另外，对转移载体中部分目的基因序列测定结果显示，转移载体中HA基因及LacZ基因没有发生碱基突变。2.3表达禽流感病毒HA基因的重组DPV的鉴定2.3.1蓝白斑筛选与纯化，将挑取的蓝斑反复纯化，直至每一个病毒蚀斑均为蓝色。2.3.2重组DPV的PCR鉴定,将收集的经纯化培养的CEF细胞，提取基因组DNA,用HA引物经PCR扩增出预期大小1700bp的HA基因目的条带，而只感染疫苗毒的细胞基因组D

21、NA未扩增出HA基因目的条带，表明HA基因成功插入DPV,并获得了表达（图5）o2.3.3重组DPV的Western-blot鉴定结果（图6）3讨论当前，禽流感（AIV）是危害养禽业和人类的更要疾病，主要原因有两个:AIV的毒力在逐渐增强，新的致病型和毒力型在不断出现;至今没有一种疫苗能真正有效地保护禽类免于AIM感染。在完善动物安全体系的理念下,AIV疫苗研究正朝着限制弱毒苗使用，优先发展灭活苗、亚单位苗-采用基因工程技术开发无感染性的新型疫苗方向发展。目前应用的HPAI疫苗主要是油乳剂全病毒灭活疫苗，它具有保护率高，免疫期长和研制周期短等优点。但灭活疫苗也存在一些难以克服的缺陷，例如灭活苗

22、不能同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫：免疫后虽能保护其免于发病和死亡，然而病毒分离结果阳性，说明用灭活苗免疫只能保护禽类在同亚型HPAIV攻击时免于发病和死亡，而不能保护其免于感染。而且其免疫效果是由注射剂扉和疫苗中的抗原含晕共同决定的，在进行免疫接种时往往需要比活疫苗高出许多倍的剂最，此外还必须添加佐剂，这就大大增加了灭活疫苗的成本。亚单位疫苗制作成本较高，免疫期短,不可能成为预防禽流感的理想疫苗。对于核酸疫苗的研究也才刚刚起步，尚有许多问题有待解决。活薮体基因重组疫苗是近年来十分关注的诸多新型疫苗中的一类，它是以利用基因工程方法改造的病毒或细菌作载体，按人们的要求表达特定免疫活性因了。随

23、着对A1V疫苗的深入研究，用于构建重组疫苗的病毒载体主:要有鸡痘病毒(FPV)、念腺病毒以及疱疹病毒。在这些重组疫苗中，重组FPV已广泛应用到生产实践中，但使用这类疫苗的缺点是无法对已接种过痘苗的鸡使用，同时无法克服母源抗体的干扰，最主要的是这些已投入使用的各种流感疫苗对于鸭、鹅等水禽抗原性差、免疫效果不确实等缺点，不适用于水禽。因此，急需构建一种适用于水禽的病毒为载体新型重组病毒疫苗。以疱疹病毒(如MDV、FPV、DPV等)作为活病毒载体构建表达A1V-HANA的载体疫苗是近凡年来国内外研究的热点。鸭瘟病毒(DPV)是典型的疱疹病毒，它的DNA具典型的疱疹病毒DNA的特征，大小约为150kb

24、,两端为末端重复序列。中间有内部重复序列。整个基因组分为U1和Us(shortuniqueregion)区，两端为TR区,U1和Us连接处有1R区。DPV作为大DNA病毒，其基因组有多个非必需区基因，具有多个插入位点，容许插入多个外源基因而不影响自身的复制和生物学特性，因而可作为-个重要的病毒载体而得到广泛应用网。TK基因是DPV研究最多的基因，缺失TK基因的DPV能在分化细胞中复制，但在神经细胞的复制能力极弱，毒力不会返强，因而更加安全。并且DPV在禽类体内存活时间较长，以该病毒作载体构建表达禽流感HA载体疫苗可在水禽体内连续产生免疫保护作用，且具有低毒，水禽易适应，可同时表达AIV的HA抗

25、原蛋白，使水禽具备抵御禽流感的体液免疫和细胞免疫特性，因而可以保护免疫水禽抵抗强毒的攻击。I我国反刍动物副产品首次出口欧盟j9+；经张家港检验检疫局检验检疫合格，一批重15.35吨、货值17.4万；t美元的烤牛鞭日前在德国顺利通关。这是我国除皮毛外的反刍动物副产tt品首次出口欧盟。长期以来，欧盟以中国部分地区存在口蹄疫疫情潜在威胁，以及疯；牛病等数据不详、风险不确定为由，拒绝进口中国的相关动物产品。为确；保此次出曰欧盟的货物出口顺利，张家港检验检疫局要求出口企业严格it按照欧盟相关规定采购原料，确保用于生产的原料安全优质，并且可追tt溯，杜绝一切可能产生风险的物质进入加工环节，并实施了生产加工

26、全；过程监控。来源：新华报业网；本研究以鸭瘟经典弱毒疫苗株DPV34F2株为亲本病毒，用PCR扩增同源重组臂，继而插入含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒和HA基因，构建了转移载体puDTCL-HA,与DPV共转染筛选表达HA的重组病毒，依靠DPV感染的形式呈递AIV的HA抗原，在有效抵抗DPV强毒攻击的同时，激发机体免疫系统产生抵抗A1V强毒攻击的反应。本试验构建的rDPV含有LacZ报告基因，报告基因LacZ在重组病毒表达外源基因的同时也得以表达，在含X-gal的培养基中呈现蓝色。重组病毒携带报告基因LacZ,可以形成蓝色蚀斑，而非重组的原禽痘病毒只能形成无色蚀斑。本研究得到了表达IIA基因的重组DPV34F2疫苗株，为进一步研究表达HA基因的重组鸭瘟病毒的免疫学特性奠定了基础。若有突破，可开发更为有效的专门适用于水禽的新型AIV疫苗，不仅可以解决当前AIV的水禽疫苗防制问题,而且可为未来AIV毒力进一步演变提供