肌动蛋白的克隆与鉴定

1、肌动蛋白的克隆与验证李亚楠 邹曾阳 孟冠奇 李军 张建忠 沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括-skeletal muscle actin，-cardiac muscle actin，-smooth muscle actin，和-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括-actin(-non-muscle)和-non-muscle actin。1-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也

2、是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。-Actin是PCR常用的内参，-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。2 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受

3、态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。关键词：-肌动蛋白 横纹肌 蛋白质 PCR1材料与方法1. 1 组织细胞DNA提取。31.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。 器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。1.1.2 方法 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管

4、数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 加2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100微升吸头挑出晾干，用200微升TE重新溶解。 加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000rpm 5min。 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混合后室温沉淀2min,离心12000rpm 10min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 用1ml 70乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm 5min。 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余

5、液滴除掉，室温干燥。 加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4或-20保存备用。1.2 PCR扩增1.2.1 器材：PCR仪、移液枪、上下引物、去离子水、反应缓冲液，模板DNA、组织DNA1.2.2 方法 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性（高温使双链DNA解离形成单链。）、退火（低温下，引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温延伸，DNA聚合酶催化引物为起始点的DNA链延伸反应与），体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 在PCR管中依次加入下列溶液：PCR预混液12.5微升、去离子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、组织DNA1微升。共

6、计25微升体系 设置PCR反应程序： 94 5min 94 30s 58 30s 32个循环 72 1min 72 8min1.3电泳仪器：水平电泳槽.电泳仪.凝胶成像分析系统.微波炉.微量移液器.透明胶带.点样板.100ml或250ml锥形瓶.量筒.吸头等。 试剂：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去离子水.1xTAE缓冲液.琼脂糖.溴化乙啶贮存液.溴化乙啶.溴酚蓝.二甲苯青.甘油.其他：DNA样品.DNA Ladder。1.3.2方法 称取1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1xTAE瓶口倒扣小烧杯100加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀即成10琼脂糖凝胶液。 胶板

7、制备：取电泳槽内有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干.放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子，将冷却到65左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子、取下胶带、将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1xTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。 加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x。用10微升微量移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应该更换一个加样头以防污染，加样时勿碰坏样品周围的凝胶面。 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100v。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，电压升高琼脂

8、糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1处时停止电泳。 观察照相：在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。 琼脂糖凝胶电泳回收 按电泳回收试剂盒操作，回收电泳。1.4 感受态细胞与T载体的连接1.4.1 设备：移液器、离心机、感受态细胞、T载体1.4.2 方法PUD-187 微升回收纯化的DNA 2微升或3-4微升，看具体浓度。 加水补至5微升，再加入5毫升SOLUTION1，冰上助融。共10微升在16摄氏度放置30分钟，之后4摄氏度过夜。1.5 细菌转化1.5.1 设备 LB液体培养基LB固体培养基，抗生素，氨苄青霉素，配成100mg/ml，

9、备用，0.1mol/L.CaCl2aq.接种针移液管，培养皿，净化工作台，摇床，恒温水浴锅，离心机。X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-D半乳糖)X-gal溶于N，N-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20避光保存，IPTG（异丙基-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。配成母液保存于-201.5.2 方法LB液体培养基： 胰蛋白酶1g，酵母粉2克，氯化钠1克，pH7.2-7.4（分装，20毫升/250毫升，三角瓶，3毫升试管0.07兆帕高压灭菌30分钟）。LB固体培养基： LB液体培养基加入1.6%琼脂

10、粉即可。（分装50毫升/250毫升，三角瓶，加入8克琼脂粉0.07兆帕高压灭菌30分钟）。 1mol/l氯化钙（称取1.1克无水氯化钙，溶于90毫升蒸馏水，定容100毫升，装在250毫升三角瓶，0.07兆帕高压灭菌30分钟，4摄氏度保存）。 从-70摄氏度冰箱中取出感受态细胞，放入冰水中融化，放置大约10分钟。 用冷却后无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（每100微升感受态细胞加连接产物5微升）旋转混合内容物，在冰上放置30分钟 在将离心管放置于42摄氏度水浴锅热激90秒，切勿摇动试管。 迅速转移到冰浴中，令细胞冷却1-2分钟。 每管加400微升的LB液体培养基，转移到37摄氏度

11、摇床温浴45分钟，转速不超过125转，使得细胞复苏（一般4-5小时菌液才能浑浊），摇完后4000转每分钟离心2-3分钟，弃去上清液200微升，使菌液浓度增加，用枪吹打后，再涂平板。平板准备 在40微升 X-gal（中加入4微升 IPTG充分混合，在无菌条件下涂布于含AMP（浓度50微升每毫升）的LB平板上将平板至于37恒温箱中2-3h，意识培养基充分吸收色素底物X-gal。涂板 将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal IPTG的平板上正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板。37培养12-18h1.6验证PCR扩增实验实验材料：仪器：吸头，PCR仪器，移液枪材料PCR预混液12

12、.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游引物1微升，组织DNA1微升实验内容及步骤：1配制25微升反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液中模板RNA 1微升上游1微升 下游引物1微升，PCR预混液12.5微升，ddH2O0.95微升。2.设置PCR反应程序3强变性 94摄氏度 5分钟变性 94摄氏度 30秒退火 58摄氏度 30秒延伸 72摄氏度 1分钟最后延伸 72摄氏度 8分钟共32 个循环1. 上样启动反应程序2. 扩增产物的电泳检测（取5毫升）电泳实验所用设备：水电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统，微波炉，微量移液器，透明胶带，点样板，锥形瓶，量筒，吸头。50XTAE,Tris溶液，

13、EDTA 溶液，去离子水，1XTAE缓冲液琼脂糖溴化乙叮贮存液，溴化乙啶，溴酚蓝，甘油，其他,DNA 样品。实验内容及步骤：1. 琼脂糖凝胶电泳的制备：称取1.5克琼脂糖置于锥形瓶中，加入150毫升 1XTAE 瓶口倒扣小烧杯100摄氏度加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成百分之1琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽洗干净晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。将内槽置于水平位置，并固定位置放好梳子，将冷却到65摄氏度左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶剂内槽放入电泳槽中，添加1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在点样

14、版上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x，用1微升微量移液管枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应更换一个加样头，以防止污染，加样时五碰坏样品周围的凝胶面。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100伏特，样品由负极向正极方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离，范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1CM处时，停止电泳。5. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带采用凝胶成像系统拍照保存。1.6.3蓝白斑筛选4设备：培养皿，移液器，x-gal，IPTG，氨苄青霉素药品配置：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖

15、）:X-gal溶于N，N-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20避光保存，IPTG（异丙基-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。配成母液保存于-20IPTG(异丙基-D半乳糖苷):0.2g/ml分装，贮存于-20摄氏度氨苄青霉素（Ampicillin）1g Ampicillin溶于5ml灭菌水中，配成母液，保存于-20摄氏度步骤：平板制备：在40微升x-gal中加入40微升IPTG，充分混合，在无菌条件下涂布于含有AMP的LB培养基平板上，将平板至于37摄氏度恒温箱中2-3小时，以使培养基充分吸收色素底

16、物x-gal。涂板：转化菌在无菌的条件下涂布于含抗生素和x-gal，IPTG的平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被吸收后倒置平板37摄氏度培养12-18小时。结果与分析本次试验成功提提取目的基因，进行PCR扩增，扩增完成后进行电泳，观察到荧光带一条处在100200bp之间，另一条荧光带处在400bp。处在400bp的原因可能是因为在进行PCR过程时温度没有达到目的要求。在进行蓝白斑验证时因为没有及时的涂匀氨苄青霉素而导致培养基中心青霉素浓度高，没有生长菌落。没有加入X-gal和IPTG的平板中分别挑取三个菌落放入液体培养基进行培养，共5个试管有三个试管长菌，原因可能是另两个没有接入菌落。质粒提取后行电泳验证，电泳表现出两条荧光带，证明实验成功。实验过程中我组组员认真严谨地按照实验要求的进行试验，齐心完成实验，从