流式细胞仪的使用程序

1、流式细胞仪的使用程序血液病实验诊断中心一.开机程序1. 检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。2. 打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂口水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。3. 将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDB河热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。4. 如果需要打印，打开打印机电源。5. 打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。6. 执行仪器PRIM或能一次，以排除Flowcell中的气泡。7. 分析样品时，先用

2、FACAFlowlgPBS进彳fHIGHRUN勺2分钟。做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，趣下右下角口色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。二?预设获取模式文件(AcquisitionTemplateFi.les)1 .从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。2. 选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）。从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。3. 选取屏幕左列绘图工具中的Histogr

3、am,同上法可绘出Histogram（直方图）。4. 将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。.本计算机中已设定两个模式文件：ACQF口EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中，ACQffi于细胞DA检测，EXP用于细胞表面标志分析。三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整1. 从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQues诟在File指令栏中打开合适的获取模式文件。2. 从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Con

4、necttoCytometer（快捷键：+B）进行电脑和仪器的连机。将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置。3. 从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps>Threshold、CompensationStatus等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。4. 在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适'"|的倍增模式（amplifiermode:线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSG口SSC多

5、以线t模式Lin测且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3贝U以对数模式Log测M;分析细胞DNAM时，FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量，且DDMParang择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量。5. 放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN流速可在HIGH或LOWK6. 在AcquisitonControl对话框中，选取Acquire,开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUPO勺。7. 在Detectors/Amps对话框中

6、，调整FSCmSSCB测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC（图内,且三群细胞合理分布。8. 在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA寸用FL2-HoThreshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质io9. 从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。10. 在Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测

7、器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。11. 在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1+FL2越域内，则需调大FL2-?%FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当12. 在Status对话框中可见:LaserPower:正常值一Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW;Lasercurrent:正常值为6Amps左右。13. 调整好的仪器设定可在InstrumentSe

8、ttings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。2. 本计算机中已有三个名叫储存于CELLQuest Folder IMMInstrSettingsSettings Files CalibFile Mast-Cell-Set胞，后者用于分析小鼠肥大细胞。FACStation G3 BD Applications及 FACStation G3 BD Files Instrument的参数文件，前二者可用于分析人白细.通过预设的获取模式文件进行样品分析1. 从苹果标志中选择CELLQUES新视窗出现后从File指令栏中选择Open,2. 从屏幕上方Acquire指令栏中，

9、选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置。3. 从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set确定。4. 在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA寸选择1024。ParameterSaved则根据不同的检测对象选择不同的参数。5. 在Acquire指令栏中，选择ParameterDescrip

10、tion,以决定文件存储位置(folder),文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel),即安排tubel,2,3的检测参数。一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DA文件夹中。文件根据日期命名。6. 在Cytometer指令栏中，选择Counters,将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计?数。7. 将样品试管放至检测区，在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。8. 微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acqu让eControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“3”，开始正式获取信号，存储数据。9. 当一定数口的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7,继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。.当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDB”Y状态，以保护激光管。五.关机程序：1. 从File中选择Quit,退出软件，选择Don'tSave至苹果屏幕。2. 用4ml1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位(vacuumison),以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位(