革兰氏染色法.总结

1、革兰氏染色法(Gram'sstain) 是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。【原理】细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌 （ G+ ）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G- ）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。【材料】【方法】按涂片干燥固定染色镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中

2、取出经3 盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.52.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。1 涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：用肉汤培养物涂片： 右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。 将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红 ( 图 1-2) ，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料( 图 1-3) ，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上

3、略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。用斜面培养物涂片：用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。2 干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。3 固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死

4、大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。4 染色：将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min 。水洗后加芦戈氏碘液处理( 媒染 )1min。水洗后用95 酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止 ( 约需 0.5min)。水洗后加石炭酸复红稀释液染色( 复染 )0.5min。水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。【结果观察】使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌( 染成紫色 ) ，哪种细菌是革兰氏阴性菌(

5、染成红色 ) 。将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。注意事项：酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。1 革兰氏染色液的制备结晶紫染液用天秤量取结晶紫5g 放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95 酒精使之溶解。加

6、入酒精全量为100m1，制成酒精饱和液( 原液 ) 。取原液 20ml ，与1 草酸铵水溶液80ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。芦戈氏碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300ml配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后加蒸馏水至300ml。供革兰氏染色媒染用。稀释石碳酸复红染液取碱性复红10g 和 95 酒精 100ml，按上述方法同制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10ml ，与 5 石碳酸水溶液90ml混合，用滤纸 . 过滤，再用蒸馏水稀释10 倍。供革兰氏染色复染用。细菌的特殊染色技术 芽孢染色荚膜染色鞭毛染色一目的要求：学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛染色原理和方法。二

7、原理：芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色， 使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时， 此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛， 一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。三实验材料：1 菌种：巨大芽孢杆菌 (B.megaterium

8、) ：营养琼脂斜面培养 20hs 产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes) ：肉汁等斜面培养20hs普通变形杆菌 (Proteus vulgaris)：营养琼脂斜面培养18hs2 染料：（ 1 ）芽孢染色用 7.6% 饱和孔雀绿液、 0.5% 蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）（ 2 ） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。（ 3 ） 鞭毛染色用硝酸银染色液 （A、B 液）; 或 Leifson 染色液（A、B、C 液）3 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、1% 盐酸、电炉、墨汁、 20%CuSO4 、95% 乙醇、擦镜纸等。四实验方法

9、与步骤：（一）芽孢染色：介绍两种常用的方法1. 孔雀绿染色法：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加法 7.6% 的孔雀绿饱和水溶液， 染色 10 分钟后，用水冲洗，再用 0.5% 蕃红花红液染色彩 1 分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。2. 石炭酸复红染色法：在一支小试管（ 10*100mm ）中，滴入 3 4 滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的 (3 4 滴 ) 石炭酸复红掖摇匀。将此试管放入沸水浴中煮10 15 分钟，使芽孢及菌体着色。取此菌液体 2 3 环在洁净的载片

10、上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色，再用吕氏美蓝液复染 1 2 分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检，结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。（二）荚膜染色法1. 方法将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上； 用接种环蘸取细菌培养液或悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加 1%HCl 冲洗，使涂片呈蓝色；用蒸馏水漂洗，除去 HCl ；，用美蓝复染 1 分钟，水洗，自然干燥后镜检。镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背景蓝紫色。由于干燥菌体收缩， 菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚

11、膜。荚膜不着色的部分宽。2. 方法 湿墨汁法（ 1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。（ 2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸收多余菌液。（ 3） 镜检。结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。3.方法 TyLer 法（ 1） 涂片：按常规法涂片，在空气中自然干燥。（ 2） 染色：用结晶紫冰醋酸染 5 7 分钟。（ 3） 用 20%CuSO4 水溶液洗，再用毛边纸吸干。（ 4） 镜检并观察结果：荚膜蓝紫色，细胞暗蓝色。（三鞭毛染色法1. 银盐染色法（ 1）清洗玻片 : 选择光滑无裂痕的玻片 ,最好选用新的。

12、为了避免玻片向后重叠，应将玻片插在专用金属架上。然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉先经煮沸，再用滤纸过滤，以除去粗颗粒） ，煮沸 20 分。取出稍冷后即用自来水冲洗，晾干。再放入浓洗液中浸泡 5 6 天。使用前取出玻片，用水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入 95% 乙醇中脱水。取出玻片，在火焰上烧去酒精，立即使用。（ 2）菌液的制备及涂片：用于染色的菌种应预先连续移接 5 至 7 代。染色前用于 接菌的培养基应是新鲜制备的， 表面较湿润，在斜面底部应有少许冷凝水。 将变形杆菌接种于肉汤斜面上， 在适宜的温度下培养 15 至 18 小时后，用接 种环挑取斜面底部菌苔数环，轻轻地移入盛有

13、1 毫升与菌种同温的无菌水 中，不要振动，让有活动能力的菌游入水中，呈轻度混浊。在最适温度下保温 10 分钟，让老菌体下沉，而幼龄菌体在无菌水中可松开鞭毛。然后从试管上端挑数环菌液，置于洁净玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端。置空气中自然干燥。（3） 染色： 滴加A液，染4至6分钟。 用蒸馏水轻轻地充分洗净A 液。 用 B 液冲去残水，再加B 液于玻片上，在微火上加热至冒蒸汽，约维持 0.5 至 1 分钟（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸部分）。 用蒸馏水洗，干燥。 镜检结果：菌体和鞭毛呈深褐色至黑色。2. Leifson染色法（ 1） 清洗玻片法同 1。（ 2）

14、 菌液的制备及涂片 菌液的制备同 1 用削尖腊笔在洁净玻片上划分3 至 4 个相等的区域。 放一小环菌液于每一区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端。在另一端用一张吸水纸吸去多余的菌液。 涂片在空气中自然干燥。（3）染色 加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后染料加入第二区，以后依此类推（相隔时间可自行决定） ，其目地是由于染色时间长短受菌种、 室内温度、湿度等因素的影响。这样便于确定最合适的染色时间，且节省材料。在染色过程中要仔细观察。 当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色膜时 , 就可用水轻轻地冲洗 , 一般约 10 至 15 分钟 . 水洗 : 在没有倾去染料的情况下就用自来

15、水轻轻洗去染料 , 否则会增加背景的沉淀。 自然干燥。 镜检。结果：细菌和鞭毛都染成红色。八染色液附录：1 硝酸银染色液A 液：丹宁酸5 克FeCl31.5 克蒸馏水100毫升待溶解后，加入1% NaOH溶液 1 毫升和 15% 甲醛溶液 2 毫升。B 液：硝酸银2 克蒸馏水100 毫升待硝酸银溶解后，取出10 毫升做回滴用。往90 毫升 B 液中滴加浓NH4OH 溶液，当出现大量的沉淀时再继续加氢氧化氨，直到溶液中沉淀刚刚消失变澄清为止。 然后用保留的 10 毫升 B 液小心地逐滴加入， 至出现轻微和稳定的薄雾为止（此操作非常关键，应格外小心）。在整个滴加过程中要边滴边充分摇荡。配好的染色液当日有效。4 小时内效果最好。2 Leifson 染色液A 液：碱性复红1.2 克95% 乙醇100 毫升B 液：丹宁酸3 克蒸馏水100毫升如加 0.2%苯酚，可长期保存。C 液： NaCl1.5 克蒸馏水100毫升染色液贮与磨口瓶中。在室温下较稳定。使用前将上述溶液的等体积混合。此混合液贮于密封性良好的瓶中置于冰箱可保存数星期。在较高温度下会因混合液发生化学变化而使着色力日益减弱。书是我们时代的生命 别林斯基书籍是巨大的力量 列宁书是人类进步的阶梯 高尔基书籍是人类知