滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的爱惜作用及机制研究

1、滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的爱惜作用及机制研究战丽彬，钟军华，路小光，隋华，韦巍【关键词】内质网；衣霉素；葡萄糖调剂蛋白78;凋亡增进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白；小鼠内质网(endoplasmicreticulum,ER)普遍存在于真核细胞中，是蛋白质合成、折叠、运输和细胞内钙离子贮存的要紧场所。内质网中钙离子紊乱和未折叠蛋白质蓄积可引发内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS),发生具有爱惜作用的未折叠蛋白反映(unfoldedproteinresponse,UPR)。内质网应激直接阻碍应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。神经系统许

2、多疾病与内质网应激相关。最近的研究说明，内质网应激介导的凋亡信号传导途径可能与阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的发病有关。本研究观看滋补脾阴方药(ZibuPiyinRecipe,ZBPYR)含药血清对由N糖链抑制剂衣霉素(tunicamycin,Tm)引发的内质网应激的阻碍，以探讨其神经爱惜机制。1材料与方式实验药物滋补脾阴方药由清朝吴澄不居集中资成汤加味而成，由红参30g,山药15g,茯苓15g,白芍15g,丹参12g,白扁豆15g,莲肉20g,石菖蒲10g,远志10g,檀香g,橘红9g,甘草9g组成，均购自大连医药集团药材公司。中药常规水煎，每毫升中药液含生药g,4&

3、#176;C保留备用。要紧试剂和仪器达尔伯克改良伊格尔培育基(Dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM)和胎牛血清,Gibco公司产品；胰蛋白酶和TRIReagent,Sigma公司产品；Tm,星形胞菌素(staurosporine,STS),日本Wako公司产品;细胞毒性检测试剂盒,Roche公司产品；RNaseOUT和Oligo(dt),Invitrogen公司产品。二氧化碳恒温培育箱，ThermoForma公司产品；台式高速冷冻离心机,Sigma公司产品；UV754紫外分光光度计，上海分析仪器总厂产品；温度梯度PCR扩增仪，ThermoHy

4、baid公司产品；酶标仪，美国BI0TEKTM公司产品；凝胶成像分析系统，UVP公司产品。中药血清制备取健康雄性SD大鼠(220250g)12只，随机分为对照组和ZBPYR组，每组6只。适应饲养3d后，ZBPYR组给予滋补脾阴方药灌胃，10ml/kg体质量，此剂量灌胃2次/d,持续3d；对照组给予等体积生理盐水灌胃。于末次给药后lh腹主动脉取血,静置2h,2000r/min,4离心15min分离血清,离心半径为cm,56,30min灭活。Um滤膜过滤除菌，一20保留备用。Neuro2a细胞的培育小鼠神经瘤母细胞Neuro2a细胞株由日本北海道大学药学部野村靖幸教授惠赠。细胞常规苏醒后加入培育液

5、于5%CO二、37培育箱培育。细胞单层长满后用终浓度为%胰蛋白酶37条件下消化3min,以1：3传代。培育液含90%DMEM、10%胎牛血清和1%双抗。细胞长至第三代能够利用。乳酸脱氢酶释放实验Neuro2a细胞接种后分为对照组、10%空白血清组、5%ZBPYR组、10%ZBPYR组、15%ZBPYR组、Tm(5Ug/ml)组、10%空白血清+Tm(5Ug/ml)组、5%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)组、10%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)组、15%ZBPYR+Tm(5Ug/ml)组。细胞单层长至70%时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5%C0二、37培育箱继续培育48h后用乳酸脱氢

6、酶(lactatedehydrogenase,LDH)释放实验检测LDH泄漏率。LDH实验步骤按试剂盒说明执行。LDH泄漏率为细胞上清中LDH活性与细胞总的LDH活性比值。LDH活性测定用酶标仪于490nm处检测。另外Neuro2a细胞接种后分为对照组、STS(Umol/L)组、10%空白血清+STS(Umol/L)组、15%ZBPYR+STS(Umol/L)组，待细胞单层长至70%时按以上分组给予相应刺激。刺激后细胞放入5%C0二、37培育箱继续培育48h后检测LDH泄漏率。逆转录聚合酶链式反映实验分组同前。细胞单层长至90%时按以上分组给予相应刺激。细胞放入5%C0二、37°C培

7、育箱继续培育6h。总RXA的提取和逆转录聚合酶链式反映。(1)搜集细胞用TRIReagent提取总RNA。用紫外分光光度计测定A260/A280,计算RNA浓度。(2)逆转录反映。反映体系为20ulo取2ug总RXA,加二乙基焦磷酰胺(diethylpyrocarbonate,DEPC)水至整体积为9U1,力口UlOligo(dt)1218引物混合后，置.70变性10min。然后加入以下成份：5X第一链缓冲液口1、10mmol/LdNTP2UKmol/LDTT2U1、RNase抑制剂U1和逆转录酶Ul,混合使反映整体系为20Hlo放入46反映h,70变性15min,冰上5min后进行扩增。(3

8、)PCR反映。在mlPCR管中加入U1逆转录产物、sdH209口1、10mmol/LdNTPUl、10XPCR缓冲液口1、聚合酶上游引物(20Umol/L)UK下游引物(20Umol/L)Hl,总反映体系为12ulo(4)PCR产物观看。PCR产物经40%丙烯酰胺凝胶电泳后，EB染色15min,用凝胶成像系统进行拍照及图像分析,然后计算待测基因与内标磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)吸光度的比值。PCR反映扩增参数如下：葡萄糖调剂蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78),945min,941

9、min,551min,72C1min,循环22圈，725min；凋亡增进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBPhomologousprotein,CHOP),945min,941min,60lmin,721min,循环25圈，725min；GAPDH,945min,9440s,5830s,7240s,循环28圈，725mine引物序列见表1。表1引物序列（略）Table1Sequenceoftheprimers统计学方式每组实验重复4次,图像分析采纳LabWorks专业图像分析软件。数据用SPSS软件进行分析，两组间不同比较采纳t查验。2结果LDH释放实验检测ZBPYR含药

10、血清对Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的阻碍各浓度含药血清和10%空白血清组与对照组相较，LDH泄漏率不同没有统计学意义,说明血清对Neuro2a细胞没有毒性作用;Tm（5Ug/ml）组与对照组相较，LDH泄漏率明显升高，不同有统计学意义（P）;10%空白血清预处置组LDH泄漏率与Tm组相较，不同无统计学意义；而各浓度ZBPYR含药血清预处置组与Tm组相较，LDH泄漏率下降明显，不同有统计学意义（POo10%药物血清预处置组与10%空白血清预处置组相较，不同有统计学意义（P）。见图1。RTPCR方式观看ZBPYR含药血清对Tm刺激Neuro2a后GRP78mRNA表达的阻碍各浓度含药血清和

11、10%空白血清组与对照组相较，GRP78mRXA表达不同无统计学意义，说明血清对Neuro2a细胞GRP78mRNA表达没有阻碍；Tm(5Hg/ml)组与对照组相较,GRP78mRXA表达明显增强(P<而加入血清预处置lh后再加入浓度为5Ug/mlTm各组与Tm(5Hg/ml)组相较，GRP78mRNA表达明显下降(P<,其中ZBPYR含药血清预处置组GRP78mRNA表达较空白血清预处置组GRP78mRA表达下降加倍明显(P<。见图2。RTPCR方式观看ZBPYR含药血清对Tm刺激Neuro2a后CHOPmRNA表达的阻碍各浓度含药血清组与对照组相较，CHOPmRXA表达不

12、同无统计学意义，说明血清对Neuro2a细胞CHOPmRXA表达没有阻碍；Tm(5Ug/ml)组与对照组相较，CHOPmRNA表达增强(P<)；10%空白血清预处置组与Tm(5Ug/ml)组相较，CHOPmRXA表达不同无统计学意义；而各浓度ZBPYR含药血清预处置组CHOPmRXA表达与Tm(5Ug/ml)组相较，不同有统计学意义(PO；10%药物血清预处置组与10%空白血清预处置组相较，CHOPmRXA表达不同有统计学意义(PV)。见图2。图1LDH检测Tm刺激细胞后各组细胞LDH泄漏率(略)Figure 1 LDHleakagefromeachgrouptreatedbyTm*P&

13、lt;,vsnormalcontrolgroup;AP<,AAP<,vsTmtreatedgroup;AP<,vs10%controlserumtreatedgroup(n=4foreachgroup).图2RTPCR法观看Tm刺激各组细胞后GRP78和CHOPmRNA表达(略)Figure 2 ExpressionsofGRP78andCHOPmRNAsindifferentgroupstreatedbyTm(RTPCR)ResultsofRTPCRelectrophoresisfromeachgroupandvaluesofI0Dfromeachgroup(n=4fore

14、achgroup).*P<,vsnormalcontrolgroup;AP<,vsTmtreatedgroup;AP<,vs10%controlserumtreatedgroup.LDH释放实验检测STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的转变STSUmol/L组与对照组比，LDH泄漏率升高(P<)；而加入15%空白血清预处置组与STS组相较，LDH泄漏率下降(PO；15%ZBPYR含药血清预处置组与STS组相较，LDH泄漏率下降(P<)；15%ZBPYR含药血清预处置组与15%空白血清预处置组相较LDH泄漏率下降加倍明显(POo见图3o图3LDH检测STS刺激细胞

15、后各组细胞LDH泄漏率（略）Figure 3 LDHleakagefromeachgrouptreatedbySTS*P<,vsnormalcontrolgroup;AP<,AAP<,vsSTStreatedgroup;AP<,vs15%controlserumtreatedgroup(n二4foreachgroup).3讨论ERS是细胞的一种应激反映进程，糖饥饿、钙平稳紊乱、糖基化抑制和二硫键合成减少等情形下，内质网的微环境发生改变，蛋白质的折叠受到阻碍，致使大量未折叠或错误折叠的蛋白质堆积于内质网内，由此引发一系列以分子伴侣和折叠酶表达上调为标志的应答反映，称为未折

16、叠蛋白反映(unfoldedproteinresponse,UPR)o通过UPR细胞才能在应激情形下存活。分子伴侣GRP78与凋亡增进因子CHOP是ERS时表达增多的两种分子，被看做是ERS的标志，在ERS中起着不同的作用。其中GRP78能爱惜细胞，而CHOP那么是增进细胞凋亡。因此通过药物干与后研究它们的表达情形能够进一步了解药物对ERS的作用。AD是一种常见的神经退行性疾病，病理特点为淀粉样蛋白的沉积、神经原纤维缠结、tau蛋白异样磷酸化和区域选择性神经元死亡loAD与基因突变有关，要紧有编码淀粉样蛋白前体基因(amyloidproteinprecursor,APP)和早老素(presen

17、ilin,PS)基因，这些基因都与内质网有关。AD相关的早老素突变，诱导内质网应激反映而且通过改变APP的蛋白水解加工作用而部份地增强对应激诱导的凋亡的易损性。PS1突变通过细胞表而有活性的钙离子流入的直接减少，不依托APP,并间接地通过APP处置作用和淀粉样肽的产生增加内质网钙离子释放来解除对神经元钙离子稳态的操纵。这种钙离子稳态的干扰将改变APP的加工，过量生成B淀粉样蛋白142(amyloid8protein142,API42),同时内质网钙失衡,激活钙蛋白激酶，切割内质网膜上的caspase12,从而激活caspase12介导的内质网特异性凋亡途径，最终形成AD的病理转变2o除钙离子失

18、调，PS突变下调UPR并增强对内质网应激的易损性30PS1突变还诱导了一个内质网中与应激介导的凋亡途径有关的凋亡前因子CHOP的表达41PS是Y分泌酶复合物的一部份，与B分泌酶一路，裂解APP产生AB,而且PS突变增加总A13和AB142的产生。AB能直接引发内质网的钙离子释放而且诱导了内质网应激和神经毒性5。因此，在AD中内质网应激是引发和调剂神经元死亡的一个要紧事件。现有研究显示在AD神经元死亡中内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径彼此阻碍，起着调控凋亡级联反映的作用6o中医以为人体的生长、发育和衰老与“肾”紧密相关。“肾精虚衰”是衰老的要紧缘故。同时又以为“脾胃为血气阴阳之根蒂”，“

19、脾胃既和,其人寿；脾胃不和，其人天”，因此也重视服侍脾胃精气在延年中的作用:7L老年痴呆发病于老年期。老年期脾胃气衰，饮食减少，脾虚那么化源不足，脑髓失养，神机失调而发为本病。因此脾虚是老年性痴呆的大体病机，脾的功能衰退在老年性痴呆发病进程中起着主导作用，并贯穿于全进程8。脾的生理功能是脾之阴阳一起作用的结果。脾阴是指存在于脾脏的阴液(包括血、津液和水谷精微等)和脾的物质形态及其滋润濡养功能。由于脾与大脑关系紧密，脾阴亏虚严峻阻碍大脑的意识、学习、思维、经历和情绪等功能，致使一系列与脑相关的精神意识病证如意识不清、学习经历能力下降和情绪失常等。因此，滋补脾阴应当是防治老年痴呆的一个重要方法。滋

20、补脾阴方药由清朝吴澄不居集中资成汤加味而成，以人参补脾益气生津，山药益胃补脾养阴，白芍养阴缓急，丹参活血养血益阴，茯苓健脾安神益智等，共奏健脾益阴之效。本组以往的研究显示，滋补脾阴方药能通过改善老龄大鼠脑细胞线粒体膜Na+K+ATP酶、Ca2+Mg2+ATP酶活性，调剂膜磷脂代谢障碍和修饰膜的作用9,和延缓兴奋性氨基酸受体N甲基D门冬氨酸(NmethylDasparticacid,XMDA)受体、Y氨基丁酸(gammaaminobutyricacid,GABA)受体染色阳性神经元在衰老进程中丧失，同时抑制神经胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)

21、的表达,起到神经爱惜、延缓脑衰老的作用10。本实验中Tm刺激Neuro2a细胞LDH释放实验结果说明，在加入滋补脾阴方药含药血清预爱惜后，能够明显降低Tm刺激细胞后的LDH泄漏率，结合RTPCR观看到滋补脾阴方药含药血清预处置后，内质网应激标志物GRP78及CHOPmRNA的表达受到抑制，两种实验结果的同步性能够推断滋补脾阴方药具有抑制内质网应激的作用。STS刺激Neuro2a细胞LDH释放实验结果说明，加入滋补脾阴方药含药血清预处置后，能够明显降低STS刺激细胞后的LDH泄漏率(STS是线粒体凋亡途径诱导剂)。因此说明滋补脾阴方药同时具有爱惜线粒体损伤的作用。以上的研究结果为滋补脾阴方药应用

22、于临床防治AD提供了依据。AD是一种常见的神经退行性病变，其发病机制复杂，目前尚无有效的医治手腕，对社会和人们的生活造成严峻的负担。现有的研究说明，神经元的凋亡在AD的发病进程中起着重要的作用。而内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径己被证明在AD的发病进程中起着协同作用。咱们的实验证明，滋补脾阴方药对内质网应激凋亡途径和线粒体损伤的凋亡途径具有双重作用，因此有助于AD的防治，加当中药医治有着毒副作用低、经济实惠的优势,更易于为人们所同意。【参考文献】1 MattsonMP.PathwaystowardsandawayfromAlzheimer'sdisease.Nature.200

23、4;430(7000):631639.2 NakagawaT,ZhuH,MorishimaN,etal.Caspase12mediatesendoplasmicreticulumspecificapoptosisandcytotoxicitybyamyloidbeta.Nature.2000;403(6765):98103.3 YasudaY,KudoT,KatayamaT,etal.FADlinkedpresenilin1mutantsimpedetranslationregulationunderERstress.BiochemBiophysResCommun.2002;296(2):31

24、3318-4 Milhavet0,MartindaleJL,CamandolaS,etal.InvolvementofGaddl53inthepathogenicactionofpresenilin1mutations.JNeurochem.2002;83(3):673681.5 SuenKC,LinKF,ElyamanW,etal.ReductionofcalciumreleasefromtheendoplasmicreticulumcouldonlyprovidepartialneuroprotectionagainstPamyloidpeptidetoxicity.JNeurochem.2003;87(6):14131426.6 TakumaK,YanSS,SternDM,etal.Mitochondrialdysfunction,endoplasmicreticulumstress,andapoptosisinAlzheimer*sdisease.JPharmacolSci.2005;97(3):312316.7 LiZP,ZhaoWK,XuPC,et