荧光定量PCR检测项目-文档资料

1、与目标序列互补5端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQTaqman实时实时PCR的反应过程的反应过程535535ForwardPrimerReversePrimerRQ535535QR535535RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧

2、光阈值、扩增曲线、荧光阈值、Ct值值扩增曲线扩增曲线扩增曲线图扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超

3、过域值Ct值CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到

4、阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域域值的循环数即值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以

5、计算出样品中所含的模板量Sample25HBV基因型的临床意义基因型的临床意义HBV标志物清除与B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg阳性率，分别为16%与53% 基因型的自发性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝脏生物化学指标持续正常。病毒致病性HBsAg阳性者中， C基因型比B 基因型的肝功能异常更为常见。C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。乙型肝炎的病程及转归亚洲无症状HBV携带中 ，与B基因型比较,C基因型在肝硬化及50岁以上的肝细胞癌患者中比例较高,而B基因型与50岁以下,特别是35岁以下的肝细胞癌患者有关。药物敏感性 B B型型 C C型型流行性流行性 低低 高高HBeAgHBeAg阳性率阳性率 低低 高高 HBeAgHBeAg自然清除时间自然清除时间 短短 长长 HBV DNA HBV DNA 载量载量 低低 高高致病性致病性 轻轻 重重HCCHCC发生率发生率 低（低年龄组高）低（低年龄组高） 高（高年龄组高）高（高年龄组高）干扰素治疗