第一篇c3临床细菌学检验技术

1、第一篇第一篇 临床微生物学检验临床微生物学检验第三章第三章 临床细菌学检验技术临床细菌学检验技术 1. 细菌形态学检查方法及细菌观察辨认指标；细菌形态学检查方法及细菌观察辨认指标；2. 染色标本检查的基本程序及革兰氏染色法；染色标本检查的基本程序及革兰氏染色法；3. 培养基概念、种类培养基概念、种类及其制备；及其制备；4. 细菌接种与分离技术；细菌接种与分离技术；5. 细菌在培养基中的生长现象及其观察指标细菌在培养基中的生长现象及其观察指标6. 常用生化反应原理、培养基、结果判定和常用生化反应原理、培养基、结果判定和 应用应用7.细菌的非培养检测方法及其意义细菌的非培养检测方法及其意义 。 是

2、是利用显微镜利用显微镜，通过，通过染色染色或或不染不染色色 标本标本, ,对对细菌的细菌的大小大小、形态形态、排列排列、特殊结构特殊结构、动力动力及及染色性染色性等特点进行观察分析的方法。等特点进行观察分析的方法。 1.可以迅速了解标本中可以迅速了解标本中有无细菌有无细菌及及大致的菌量大致的菌量 ；2.根据细菌的形态、结构和染色等根据细菌的形态、结构和染色等初步判断初步判断 ；3.对对进一步进一步 的细菌生化和血清学的细菌生化和血清学鉴定鉴定、临床初步、临床初步诊断、选择抗生素等诊断、选择抗生素等 提供依据提供依据 。 种类种类 特点特点 用途用途普通光学显微镜普通光学显微镜 可见光可见光直射

3、直射, 千倍千倍 染色细菌染色细菌形态结构形态结构暗视野显微镜暗视野显微镜 散射光散射光,暗视野聚光器暗视野聚光器 活菌活菌/螺旋体的螺旋体的 相差显微镜相差显微镜 相差板相差板变光相与振幅变光相与振幅 活菌活菌荧光显微镜荧光显微镜 高压汞灯高压汞灯紫外光紫蓝光紫外光紫蓝光 辅助诊断辅助诊断 荧光素标记细菌病毒荧光素标记细菌病毒电子显微镜电子显微镜 电子流电子流，强磁透镜透射，强磁透镜透射 扫描，数十万扫描，数十万一百万一百万 实验室常用显微镜实验室常用显微镜【补充内容】【补充内容】 普通光学显微镜的分辨率为普通光学显微镜的分辨率为0.25um0.25um。一般细。一般细菌都大于菌都大于0.2

4、5um0.25um，故可用普通光学显微镜观察。，故可用普通光学显微镜观察。n目的：目的：主要观察主要观察的的及及n常用方法：常用方法：压滴法、压滴法、和毛细管法和毛细管法n常用显微镜：常用显微镜： 、相差显微镜、相差显微镜、n观察：观察：有鞭毛细菌有鞭毛细菌 无鞭毛细菌无鞭毛细菌布朗运动（原地颤动）布朗运动（原地颤动）n常见细菌运动常见细菌运动流星样流星样/穿梭样运动穿梭样运动(霍乱弧菌霍乱弧菌)；投镖样；投镖样/螺旋样螺旋样运动运动(空肠弯曲菌空肠弯曲菌)；翻滚螺旋运动；翻滚螺旋运动(小肠耶尔森小肠耶尔森菌菌)；旋转；旋转/伸屈伸屈/滚动滚动/蛇行运动（梅毒螺旋体）蛇行运动（梅毒螺旋体）压滴

5、法压滴法悬滴法悬滴法 影响因素影响因素1. 避免菌液外溢和产生气避免菌液外溢和产生气泡，并造成生物污染。泡，并造成生物污染。2.尽快观察，注意保温尽快观察，注意保温3.玻片厚度玻片厚度1.0- 1.1mm，清，清洁无油渍洁无油渍4.光线不宜过亮。光线不宜过亮。清楚观察细菌清楚观察细菌(死菌死菌)的的、和和n碱性染料：碱性染料：带正电荷；常用结晶紫、美兰、孔雀带正电荷；常用结晶紫、美兰、孔雀绿、碱性复红等；细菌带负电荷，易被碱性染料绿、碱性复红等；细菌带负电荷，易被碱性染料染色。染色。n酸性染料：酸性染料：带负电荷；常用伊红、酸性复红等带负电荷；常用伊红、酸性复红等 n中性染料：中性染料：碱性染

6、料碱性染料+ +酸性染料，也称复合染料酸性染料，也称复合染料n细菌学中细菌学中、的染色法的染色法n根据染色结果，把细菌分为根据染色结果，把细菌分为G+菌和菌和G-菌菌染色结果为染色结果为染色结果为染色结果为n目的目的对病原菌的初步鉴定对病原菌的初步鉴定为临床选择用药提供参考为临床选择用药提供参考致病性不一样致病性不一样,指导临床制定治疗方案指导临床制定治疗方案1.1.涂片：涂片：液体标本直接涂片；液体标本直接涂片； 固体培养物固体培养物+ +生理盐水生理盐水涂布涂布2.2.干燥：干燥：切勿高温，以防高温使细菌变形切勿高温，以防高温使细菌变形3.3.固定：固定：目的？目的？杀死细菌；改变细胞壁通

7、透性；菌体与玻片牢固黏附杀死细菌；改变细胞壁通透性；菌体与玻片牢固黏附 4.4.染色：染色：单染法单染法、复染法复染法 复染色法一般步骤：复染色法一般步骤：初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染5.5.镜检：镜检：干燥后；油镜观察干燥后；油镜观察制片制片 涂片涂片 干燥干燥 固定固定结晶紫结晶紫 碘液碘液 95%乙醇乙醇 复红复红1min1min 脱色脱色染色染色 原理原理 渗透学说渗透学说（细胞壁结构）（细胞壁结构）化学学说化学学说 等电点学说等电点学说 革兰阳性革兰阳性 革兰阴性革兰阴性1.涂片涂片取菌（标本）过程严格无菌操作；取菌（标本）过程严格无菌操作； 涂片厚薄均匀，一般涂呈云雾状薄片，拇

8、指大小；涂片厚薄均匀，一般涂呈云雾状薄片，拇指大小；2.自然自然干燥干燥为好，若烘干要缓慢，玻片不烫手为度；为好，若烘干要缓慢，玻片不烫手为度； 玻片标本必须经固定，一般火焰快速往返玻片标本必须经固定，一般火焰快速往返3次；次；3. 玻片稍放凉方能加染料染色；玻片稍放凉方能加染料染色； 染料染料加量适宜，要覆盖整个涂片区域并不外流；加量适宜，要覆盖整个涂片区域并不外流；4. 染色染色步骤的顺序步骤的顺序不能调乱，不能调乱，时间时间严格把握，但脱色时严格把握，但脱色时间可依涂片厚薄适当调整；间可依涂片厚薄适当调整；5. 冲水时连同染料随流水冲去，不宜先将染料倒去再冲冲水时连同染料随流水冲去，不宜

9、先将染料倒去再冲6. 染色完毕要待玻片完全干燥才能滴油镜检。染色完毕要待玻片完全干燥才能滴油镜检。n常用于常用于等抗酸菌的检查等抗酸菌的检查n抗酸菌染成红色，其他背景染成蓝色抗酸菌染成红色，其他背景染成蓝色 n敏感性强，容易观察结果敏感性强，容易观察结果n用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察 n仪器设备仪器设备接种环接种环/针针红外接种灭菌器红外接种灭菌器/酒精灯酒精灯培养皿（平皿）培养皿（平皿）培养箱培养箱高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器干烤箱干烤箱超净台超净台/生物安全柜生物安全柜n平皿平皿是指用是指用而成，专供而成，专供使用的混合使用的混合。1. 按培养基的按培养基的分分2.按培养基的按培养基的

10、分分合成培养基合成培养基天然培养基天然培养基液体培养基液体培养基半固体培养基半固体培养基固体培养基固体培养基 (斜面、平板斜面、平板)液体培养基液体培养基+2-3%+2-3%琼脂琼脂固体培养基固体培养基+0.2-0.5%+0.2-0.5%琼琼脂脂半固体培养基半固体培养基用于大量繁殖细菌用于大量繁殖细菌 （增菌）（增菌）动力检查动力检查保存菌种保存菌种平板平板细菌分离培细菌分离培养养斜面斜面增菌增菌纯培养纯培养保存菌种保存菌种3.3.按培养基的按培养基的分分 基础培养基基础培养基：含细菌生长繁殖所需的基本营养：含细菌生长繁殖所需的基本营养成分，是成分，是。普普通通营营养养肉肉汤汤普通营养琼脂平板

11、普通营养琼脂平板普普通通营营养养琼琼脂脂斜斜面面 ：在基础培养基中加入血液、血清、：在基础培养基中加入血液、血清、鸡蛋、葡萄糖等营养物质，鸡蛋、葡萄糖等营养物质，。 血琼脂平板血琼脂平板（除了提供营养外，还能观察细（除了提供营养外，还能观察细菌的溶血现象，用于鉴定）菌的溶血现象，用于鉴定）巧克力色血平板巧克力色血平板：在培养基中加入抑制剂，目的是：在培养基中加入抑制剂，目的是的生长，的生长，的生长。的生长。 SS平板平板胆盐抑制胆盐抑制G+菌生长；煌绿和枸椽酸钠抑制非致病性菌生长；煌绿和枸椽酸钠抑制非致病性肠道杆菌生长，利于沙门菌和志贺菌的生长。肠道杆菌生长，利于沙门菌和志贺菌的生长。鉴别培养

12、基鉴别培养基：利用细菌的分解代谢能力和产物的：利用细菌的分解代谢能力和产物的不同，在培养基中加入了一些特定的作用底物和指不同，在培养基中加入了一些特定的作用底物和指示剂，通过指示不同的生化反应来鉴别细菌。示剂，通过指示不同的生化反应来鉴别细菌。伊红美兰伊红美兰(EMB)平板平板 （选择（选择+鉴定）鉴定）各种生化反应试剂各种生化反应试剂特殊培养基：特殊培养基：厌氧培养基厌氧培养基：专供：专供的分离、培养和鉴别。的分离、培养和鉴别。 （如疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基等）（如疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基等）细菌细菌L L型培养基型培养基：加入：加入3 35% NaCl5% NaCl、10102

13、0%20%蔗糖蔗糖 或或7%7%聚乙烯吡咯烷酮等低营养琼脂培养基。聚乙烯吡咯烷酮等低营养琼脂培养基。营养肉汤营养肉汤普通肉渣普通肉渣石蜡石蜡疱肉培养疱肉培养基基临床标本临床标本兼性厌氧菌培养基兼性厌氧菌培养基备注备注血、骨髓血、骨髓血培养液血培养液, BA, CA必要时做厌氧培养必要时做厌氧培养LKV或或CAN穿刺液、脓汁穿刺液、脓汁BA, CA, MAC脑脊液脑脊液BA, CA尿液尿液BA, MAC同时做尿液计数同时做尿液计数粪、肛拭粪、肛拭SS, MAC, EB弧菌科感染加弧菌科感染加TCBS痰液痰液BA, MAC结核患者用结核患者用L-J培养基培养基生殖道分泌液生殖道分泌液 BA, CA

14、, TM或或MTM 真菌感染用沙氏培养基真菌感染用沙氏培养基临床常见标本培养基的首选原则临床常见标本培养基的首选原则注：注：BA:血平板；血平板；CA:巧克力平板；巧克力平板；MAC:麦康凯平板；麦康凯平板；SS:沙门菌志贺沙门菌志贺菌选择平板；菌选择平板；TCBS:硫代硫酸盐硫代硫酸盐-枸橼酸盐枸橼酸盐-胆盐胆盐-蔗糖平板；蔗糖平板；EB:肠道增肠道增菌肉汤；菌肉汤；TM或或MTM: 用于淋球菌培养；用于淋球菌培养；LKV:万古万古/卡那霉素溶血培养基；卡那霉素溶血培养基；CAN:黏菌素黏菌素-萘啶酸厌氧培养基；萘啶酸厌氧培养基；L-J：改良罗氏培养基；：改良罗氏培养基；根据根据标本类型标本

15、类型、检验目的检验目的及及培养基的性状培养基的性状，采用不同的分离和培养方法采用不同的分离和培养方法1.平板划线法：平板划线法：分离出单个菌落分离出单个菌落 分区划线法分区划线法含菌量多的标本含菌量多的标本 连续划线法连续划线法含菌量少的标本含菌量少的标本2. 斜面接种法：斜面接种法：纯培养、增菌、保存菌种、生化试验纯培养、增菌、保存菌种、生化试验3. 液体接种法：液体接种法：增菌、生化试验管的接种增菌、生化试验管的接种4. 穿刺接种法：穿刺接种法：动力试验动力试验(半固体半固体)、高层琼脂、高层琼脂5. 倾注平板法：倾注平板法：定量培养、细菌计数定量培养、细菌计数6. 涂布接种法：涂布接种法

16、：药敏试验药敏试验K-B法、细菌计数法、细菌计数目的：目的：把含菌量多的临床标本接种到固体培养基表把含菌量多的临床标本接种到固体培养基表 面，并将其分散，从而面，并将其分散，从而。方法：方法：分区划线，逐步稀释；每区从分区划线，逐步稀释；每区从“点点”“线线”， 使标本分散、稀释。使标本分散、稀释。（1 1）严格遵循无菌操作并）严格遵循无菌操作并无污染菌无污染菌；（2 2）达到分离目的达到分离目的，获得尽可能多的单个独立菌落，获得尽可能多的单个独立菌落（3 3）分区明显分区明显，能充分利用培养基面积；，能充分利用培养基面积；（4 4）力度、角度适宜，不划破琼脂；）力度、角度适宜，不划破琼脂；（

17、5 5）线条密而不重叠（）线条密而不重叠（1 1区可除外），连接适合，区可除外），连接适合， 不多交、少交、漏交及错交；不多交、少交、漏交及错交；先加先加1ml样品样品倾注培养基倾注培养基 1. 需氧培养需氧培养 临床细菌室临床细菌室的方法的方法 适用于适用于的培养；的培养； 常常于于(因菌种而异因菌种而异) ，培养，培养 ； 2. 二氧化碳培养法二氧化碳培养法 CO2培养箱；烛缸法培养箱；烛缸法 微需氧微需氧(5%6%O2+5%10%CO2+85%N2) 3. 厌氧培养：厌氧培养：化学产气法；专用厌氧培养箱化学产气法；专用厌氧培养箱 同一份标本常同时采用同一份标本常同时采用23 种不同的培养

18、法种不同的培养法CO2培养箱培养箱1. 1. 在在液体培养基液体培养基中的生长情况中的生长情况菌膜菌膜菌沉淀菌沉淀均匀浑浊均匀浑浊对照对照【】2.2.在在半固体培养基半固体培养基中的生长情况：中的生长情况： 有鞭毛的细有鞭毛的细菌菌可沿穿刺线可沿穿刺线扩散生长，扩散生长，呈呈或或无鞭毛细菌无鞭毛细菌(动力动力-)只能沿穿刺线生长，呈只能沿穿刺线生长，呈线状线状, 线两旁线两旁培养基澄清培养基澄清划线接种划线接种18-2418-24小时培养后小时培养后, ,可见可见菌落菌落由由分裂繁殖后形成的分裂繁殖后形成的的的。菌落特征的描述（。菌落特征的描述（大小大小、形态形态、颜色颜色、气气味味、透明度透

19、明度、表面突起或扁平表面突起或扁平、光滑或粗糙光滑或粗糙、湿润湿润或干燥或干燥、边缘整齐与否边缘整齐与否、其他特征等）、其他特征等）3.3.在在固体培养基中固体培养基中的生长情况：的生长情况： 细菌在固体细菌在固体培养基上繁培养基上繁殖成的一片殖成的一片密集的的细密集的的细菌群落。菌群落。 光滑型（光滑型（S型型）菌落）菌落粗糙型粗糙型 ( (R型型) )菌落菌落黏液型（黏液型（M 型型）菌落）菌落大分子营养大分子营养物质物质(糖、蛋糖、蛋白质等白质等)胞外酶胞外酶单糖、短单糖、短肽、脂肪酸肽、脂肪酸细菌的分解代谢：细菌的分解代谢：丙酮酸丙酮酸细菌的生化鉴定技术：细菌的生化鉴定技术：利用利用生

20、化试验生化试验的方法来的方法来检测细菌检测细菌对各种基质的对各种基质的代谢作用代谢作用及其及其代谢产物代谢产物，从而从而鉴别细菌鉴别细菌的方法。的方法。( (一一) )碳水化合物的代谢试验碳水化合物的代谢试验 1. 糖糖( (醇、苷醇、苷) )类发酵试验类发酵试验 2. 氧化氧化-发酵发酵( (O/F) )试验试验 3.-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(ONPG)试验试验 4. 七叶苷水解试验七叶苷水解试验 5.甲基红试验甲基红试验(M) 6. V-P( (伏伏-普普) )试验试验(V)( (二二) )蛋白质和氨基酸的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验 1. 明胶液化试验明胶液化试验 2.吲哚吲哚( (靛

21、基质靛基质) )试验试验(I)(I) 3. 硫化氢试验硫化氢试验( (S) ) 4. 尿素分解试验尿素分解试验( (U) ) 5. 苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验 6.氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验试验试验原理原理培养基培养基原色原色 结果观察结果观察阳性结果阳性结果 应用应用糖醇苷糖醇苷类发酵类发酵各种糖发各种糖发酵管酵管红红/紫紫 直接观察直接观察 黄色黄色 O/F H-L液液 紫紫直接观察直接观察 黄色黄色ONPGONPG液液 无色无色 直接观察直接观察 黄色黄色七叶苷七叶苷七叶苷七叶苷 黄色黄色 直接观察直接观察 黑色黑色甲基红甲基红葡萄糖蛋葡萄糖蛋白胨水白胨水淡黄淡黄滴加甲基

22、红滴加甲基红 红色红色 V-P滴加甲液滴加甲液(-奈酚酒奈酚酒精精) 和乙液和乙液(KOH) 碳水化合物的代谢试验碳水化合物的代谢试验+-对对照照糖糖(醇、苷醇、苷)类发酵试验类发酵试验最主要和最基本的生化试验最主要和最基本的生化试验氧化氧化/ /发发酵（酵（O/F）试验）试验石蜡石蜡发酵型发酵型(F)氧化型氧化型(O)产碱型产碱型(-/-)(-/-)石蜡石蜡石蜡石蜡肠杆菌科肠杆菌科(F)(F)与非发酵菌与非发酵菌(O/-)(O/-)的鉴别的鉴别+-迟缓发酵乳糖的细菌迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定的快速鉴定ONPG试验试验七叶苷水解试验七叶苷水解试验D D群链球菌群链球菌(+)(+)与其他与其他

23、链球菌链球菌(-)(-)的鉴别的鉴别甲基红甲基红(M)试验试验肠杆菌科的鉴别；一般肠杆菌科的鉴别；一般M+，V-V-P试验试验接种培养接种培养后，先滴后，先滴加甲基红加甲基红试剂再观试剂再观察结果察结果接种培养后接种培养后先滴加先滴加VP甲甲液、乙液各液、乙液各1滴，再观滴，再观察结果察结果试验试验原理原理培养基培养基原色原色 结果观察结果观察 阳性结果阳性结果 应用应用 明胶明胶明胶明胶 无无直接观察直接观察 液化液化 吲哚吲哚 蛋白胨水蛋白胨水 淡黄淡黄滴加靛基滴加靛基质试剂质试剂两液交界面两液交界面玫瑰红色玫瑰红色硫化氢硫化氢醋酸铅醋酸铅 无色无色 直接观察直接观察 黑色黑色尿素酶尿素酶

24、尿素尿素 淡橙淡橙 直接观察直接观察 玫红色玫红色苯丙氨苯丙氨酸脱氨酸脱氨苯丙氨酸苯丙氨酸琼脂琼脂 无色无色 滴滴FeCl3 4-5滴滴 绿色绿色氨基酸氨基酸脱羧酶脱羧酶赖赖/鸟鸟/精精氨酸氨酸 棕色棕色 直接观察直接观察 紫色紫色蛋白质和氨基酸的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验明胶液化试验明胶液化试验半固体半固体液化液化-+吲哚试验吲哚试验(I) 肠杆菌科细菌的鉴定肠杆菌科细菌的鉴定_+大肠埃希菌大肠埃希菌- 沙门菌沙门菌+大肠埃希菌大肠埃希菌+ 沙门菌沙门菌-硫化氢试验硫化氢试验(S)尿素分解试验尿素分解试验对对照照阳阳性性阴阴性性肠杆菌科中变形杆菌属肠杆菌科中变形杆菌属(+)(+)的鉴定

25、的鉴定苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验 对对照照管管赖赖氨氨酸酸鸟鸟氨氨酸酸精精氨氨酸酸石蜡石蜡 肠杆菌科细菌的鉴定肠杆菌科细菌的鉴定 应用于肠杆菌科细菌的鉴定应用于肠杆菌科细菌的鉴定 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验(C) 丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验原原色色为为绿绿色色蓝蓝色色为为阳阳性性阳性阳性阴性阴性直接观察结果直接观察结果(三三)碳源和氮源利用试验碳源和氮源利用试验 1. 氧化酶试验氧化酶试验肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌(-)(-)与假与假单胞菌单胞菌(+)(+)的鉴别的鉴别（）（）（+ +）( (四四) )各种酶类试验各种酶类试验挑取挑取菌落菌落

26、于滤于滤纸上纸上滴加氧滴加氧化酶试化酶试剂，菌剂，菌落变紫落变紫 2. 触酶触酶( (过氧化氢酶过氧化氢酶) )试验试验产生气泡产生气泡（+ +）无气泡无气泡（- -） G+G+球菌的初步分类球菌的初步分类( (葡萄球菌葡萄球菌+ +、链球菌、链球菌-)-)3. 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验+原理：原理：P40培养基：培养基：硝酸盐试剂硝酸盐试剂原色：原色：无或淡黄色无或淡黄色结果观察：结果观察：培养后滴加培养后滴加甲甲液液(对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸)、乙液乙液(萘胺萘胺)各各1滴滴阳性颜色：阳性颜色：红色红色应用：应用：肠杆菌科、假单胞肠杆菌科、假单胞菌及厌氧菌的鉴定菌及厌氧菌的鉴定- - 4. 脂酶试验脂酶试验操作同氧化酶试验，操作同氧化酶试验，深蓝色为深蓝色为+用于厌氧菌的鉴别用