抑制MUC1胞内段对人肺腺癌A549细胞放疗敏感性影响

1、抑制MUC1胞内段对人肺腺癌A549 细胞放疗敏感性影响作者简介：杨文影，女，重庆市渝中区人，硕士研究生，研究方向：肿瘤基因放疗增敏，E-mail：912332974 通讯作者：陈晓品，电话，E-mail：cxp640910基金项目：重庆市自然科学基金一般项目（基金号：cstc2013yykfA10004）杨文影1吴永忠2辇伟奇2郭启帅2周伟2易守会1王娟2陈晓品1*1 重庆医科大学附属第一医院肿瘤科，重庆 400010；2.重庆市肿瘤医院肿瘤科，重庆 400011摘要 目的：研究MUC1胞内段抑制剂GO-201对体外培养的人肺腺癌A549细胞放射敏感性影响及其可能

2、分子机制。方法：采用MUC1高表达细胞株A549用于实验，MTT检测不同剂量以及不同时间GO-201组对A549细胞的增殖抑制率；克隆形成实验检测GO-201对A549放射增敏作用，单击多靶模型拟合细胞存活曲线并计算Dq、D0、SF2值和放疗增敏比(SER)；流式细胞术及western-blot分别检测各实验组细胞活性氧水平及锰超氧化物歧化酶表达变化。结果：MUC1胞内段抑制剂GO-201可抑制A549细胞的增殖，并且对肺腺癌A549细胞株具有放射增敏作用，其放疗增敏比SER为1.14；GO-201与射线联合作用于A549细胞后，活性氧较对照组明显升高，锰超氧化物歧化酶蛋白表达量较对照组明显下

3、降(P0.05)。结论：抑制MUC1胞内段功能可增加A549细胞的放疗敏感性。关键词：肺癌; GO-201; 活性氧; 放射敏感性中图分类号: R734.2MUC1 cytoplasmic domain inhibitor infulence on the radiosensitivity of lung cancer cells YANG Wenying1 WU Yongzhong2 NIAN Weiqi2 GUO Qishuai2 ZHOU Wei2 YI Shouhui1 WANG Juan2 CHEN Xiaopin11.Department ofOncology，The First

4、Affiliated Hospital Of Chongqing MedicalUniversity,Chongqing 400010;2. Department of Oncology,Chongqing Cancer Hospital 400011Abstract Objective: To explore the radiosensitive effect of GO-201 on lung cancer cell line A549 cultured in vitro and its possible mechanism. Methods: MTT assay was used to

5、detecte the growth inhabition rate; the radiosensitive effect was detected by clone formation test. Cell survival cure was fitted by multitarget one-hit model and Dq, D0, SF2, sensitizing enhancing vatio (SER) was calculated. Additionally, flowcytometry and western blot were also conducted to observ

6、e the influence of GO-201 and radiation on cell reactive oxygen species(ROS) and the expression of manganese superoxide dismutase (MnSOD) protein. Results: GO-201 could inhibit the proliferation of lung cancer cell with a dose and time effect; and enhanced radiosensitivity of A549 cells, the SER is

7、1.14.Flow cytometry analysis obviously increased cell ROS in the effect of GO-201 and radiation. the expression of MnSOD protein was decreased in the action of GO-201 and radiation by using western blot(P0.05). Conclusion: inhibiting MUC1 cytoplasmic domain can improve the radiosensitivity of lung c

8、ancer cell by its effect on the level of reactive oxygen species(ROS).Key words: lung cancer; GO-201; ros; radiosensitivityMUC1是一种异质二聚体跨膜糖蛋白，在超过80%非小细胞肺癌中的腺癌亚型中,呈异常过表达状态，与无病生存期短及总体生存率低相关1-3。异常表达的MUC1作为癌基因导致正常细胞恶性转化以及肿瘤的发生与发展，并可对化疗药物，活性氧及低氧诱导的凋亡产生抵抗4-9。MUC1癌基因功能被认为是MUC1胞内段（MUC1-CT）与多种信号分子相互作用的结果。GO-2

9、01是一种小分子抑制剂，其可抑制MUC1胞内段二聚体化，阻滞MUC1-C转位到细胞核及线粒体从而影响其信号传导功能。体内外实验发现GO-201可通过阻滞MUC1-CT活化PI3K-AKT信号通路，导致肿瘤退化10。本实验着重探讨MUC1胞内段抑制剂GO-201与射线联合对体外培养的人肺腺癌A549细胞的放疗敏感性影响及其可能机制，以期为临床治疗提供一定的实验室理论依据。1 材料与方法1.1 材料及设备人肺腺癌A549细胞株由重庆医科大学附属第一医院肿瘤分子与表观遗传学实验室馈赠。鼠抗人 MUC1 单克隆抗体（CD227）、同型对照小鼠 IgG 抗体购于BD公司。GO-201购于sigma公司。

10、胎牛血清，1640培养基购于Hyclone。X线加速器：美国瓦里安；细胞培养箱为日本生产。1.2 方法1.2.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞株在含10%灭活胎牛血清的PRMI-1640培养基中，于37, 5% CO2饱和湿度条件下传代培养。取对数期细胞用于实验。1.2.2流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞MUC1 表达收集细胞，用PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1107 个m l，取100 ul加入EP管内，分别加入1ugAlex-488标记MUC1抗体和2ul同型对照小鼠 IgG 抗体， 4避光孵育30分钟；加入PBS洗涤3次，2500rpm离心5分钟。加入400ulPBS重悬细胞；流式细胞

11、仪检测A549细胞MUC1表达。 1.2.2 细胞照射条件6MV-X线等中心照射，机架旋转180，源皮距(SSD)100 cm，剂量率300cGy/min。为使射线分布均匀，照射时在培养板下置1.5cm厚的组织等效填充物。1.2.4 MTT实验取对数生长期肺腺癌A549细胞用于实验。细胞经胰酶消化离心，细胞计数，每孔接种4000个细胞于3块96孔板中，375%CO2培养箱中培养。24小时后，弃去旧培养液，加入含GO-201浓度为0.0（对照组）1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 umol/L培养液100 ul，另设一空白对照组（只加培养液，不加细胞与药物）。每组3个复孔，于37培养箱中分

12、别继续培养24h，48h，72h后，每孔加入MTT 20 ul，37培养箱继续培养4h后终止。加入150 ul DMSO,室温状态下振荡10分钟，待结晶溶解，酶标仪检测其在490nm波长处的吸光值A值（absorbance）。计算各组细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=(对照组A值实验组A值)/对照组A值100%，实验重复3次，取平均值。1.2.5 平板克隆形成实验取对数期细胞用于实验，实验分组：对照组（不加GO-201组）；单独射线组（2Gy，4Gy，6Gy，8Gy照射剂量）；单独药物组（5umol/L GO-201组）；联合组（5umol/L GO-201作用48h后，再用2Gy，4Gy，6G

13、y，8Gy剂量射线照射）。继续培养13-14d。待细胞长成肉眼可见的克隆时终止培养。甲醇固定15 min，结晶紫染色。低倍镜下计数大于50个细胞的克隆数。实验独立重复3次。集落形成率(PE)=对照组集落数/对组组接种的细胞数100%；存活分数（SF）=某一剂量照射组所形成的集落数/（该组细胞接种数PE）。根据多靶单击模型公式SF=1-(1-eD/D0)N，用Graphpad Prism6.0软件拟合细胞存活曲线，计算细胞放射敏感性参数：平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)、2GY照射时的细胞存活分数、外推数(N)以及放射增敏比(SER)。1.2.6 细胞内活性氧含量检测实验分为对照组（不加G

14、O-201）、药物组（5 umol/L GO-201）、4GY射线组、联合组（5 umol/L GO-201作用48h+4GY射线），24h后去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，37细胞培养箱内孵育40min后，无血清细胞培养液洗涤细胞3次。收集细胞流式检测各组细胞荧光强度值，实验重复3次。1.2.7 Western blot检测各实验组细胞内MnSOD水平细胞分组及处理同1.2.6。采用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并进行定量。按照每孔50 g总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗(MnSOD 1:1000) 4过夜，二抗

15、(-actin 1:2000) 37孵育1h，ECL化学发光，Bio-ad凝胶成像系统采集图像，Quantity One软件进行灰度值分析，实验重复3次。1.2.8 统计学处理 实验数据以表示，应用Origin8.1统计软件进行单因素方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。Graphpad Prism6.0拟合细胞存活曲线。2.结果2.1 肺腺癌A549细胞MUC1的表达MUC1 作为癌蛋白和肿瘤抗原，表达于大多数上皮来源的腺癌细胞和部分血液系恶性肿瘤细胞表面，为研究肺腺癌A549细胞MUC1 表达情况，利用鼠抗人 MUC1 单克隆抗体（CD227）通过流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞 MU

16、C1 表达，结果显示：93.85%的A549细胞表达 MUC1(图a)。93.856.290.2899.73图a：MUC1在A549细胞中的表达 C.001为同型对照；T.001为实验组2.1 GO-201对肺腺癌A549细胞抑制率MTT结果说明GO-201浓度在1-10umol/L之间对A549细胞的抑制作用，随着浓度升高，作用时间延长，抑制作用增强，表现出浓度及时间依赖性(P0.05)(图b), GO-201作用24h、48h、72h 后，其IC50分别是30.79umol/L、23.32umol/L、13.60umol/L。本实验选取5.0umol/L为后续实验浓度。 图b: GO-20

17、1对A549细胞增殖抑制作用2.2 GO-201的放射增敏作用根据细胞克隆形成实验，单击多靶模型绘制细胞存活曲线表明GO-201联合射线组的D0、Dq、N值以及SF2均小于单独照射组，放疗增敏比SER=1.14（表1）。图c可以看出联合组的存活曲线较对照组整体下移，各亚剂量点的存活分数均低于单独射线组；曲线肩区缩小变窄，说明细胞损伤修复能力降低。表1：GO-201对A549细胞放射敏感性的影响组别D0DqNSF2单独放疗组2.391.431.820.65GO-201+放疗2.100.801.470.51图c: GO-201联合射线时肺腺癌A549细胞存活曲线（GO-201+射线组已扣除GO-2

18、01的影响）2.3 各实验组细胞内活性氧水平检测细胞经GO-201、放射线、以及GO-201+放射线处理后，细胞内活性氧含量(对应荧光强度)与对照组比较分别升高了1.310.11, 1.430.06, 2.020.07倍，差异具有统计学意义（P0.01）。联合组比药物组及射线组活性氧含量明显升高（P0.001）(图d)，差异具有统计学意义。图d:各实验组活性氧相对含量C:对照组；D:药物组；R:射线组；D+R:联合组*P0.01; #：P0.0012.4 各处理组细胞内蛋白水平表达变化。细胞经GO-201+放射线、GO-201、放射线处理24h后，MnSOD相对表达量分别为（0.350.02）

19、、（0.610.04）、（0.560.07），较对照组（1.120.20）均有明显下降(P0.05)，且联合组蛋白表达量与药物组及射线组相比明显降低，差异具有统计学意义（P0.01）（图e）。图e：细胞内MnSOD蛋白表达变化C：对照组；D：药物组；R：射线组；D+R:药物与射线联合组*:P0.05; *:P0.01 3.讨论肺癌是世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，其治疗需要采用综合治疗手段，放疗作为肺癌治疗的一种重要手段，不仅可用于早期及局部晚期病例的治疗，对于晚期病例，合理地选择放射治疗，也能达到一定的姑息治疗效果。但临床上常遇到某些患者由于肿瘤体积过大，血功不良，导致肿瘤细胞乏氧，从而对

20、射线表现出一定的抗拒，加大剂量将会对周围正常组织造成损伤，限制了放疗疗效的进一步提高。因此，寻找一种理想的放疗增敏剂既能抑制肿瘤细胞的生长，又可以增加肿瘤细胞对射线的敏感性，成为当前抗肿瘤研究的热点。MUC1属于粘蛋白家族成员之一，其在多种恶性肿瘤中异常过表达，可通过激活多种信号传导通路以促进细胞生长及肿瘤进展。MUC1胞质区域二聚体化是其转位到胞核及线粒体发挥癌基因功能的前提，GO-201是一种小分子短肽抑制剂，体内外研究表明其可阻止MUC1-C介导的PI3K-AKT10 、NF-KB11以及STAT312信号通路的激活，从而抑制细胞生长、促进细胞死亡、导致肿瘤退化。本实验发现MUC1胞内段

21、抑制剂GO-201可明显抑制体外培养的人肺腺癌A549细胞增殖能力，表现出时间与剂量依赖性。且与射线联用在抑制肿瘤细胞克隆形成率上具有协同作用，联合组的存活曲线较对照组整体下移，各亚剂量点的存活分数均低于单独射线组；曲线肩区缩小变窄，说明细胞亚致死性损伤修复能力降低。有研究发现13沉默MUC1基因表达可促进肿瘤细胞凋亡，降低ATM对射线诱导的DNA损伤的修复，从而增加肿瘤细胞对射线的敏感性。结合本实验结果推测抑制细胞亚致死性损伤修复能力可能与GO-201放疗增敏作用有关。正常细胞在代谢过程中产生活性氧，其可介导某些生长因子以及活化的Ras所诱导的细胞有丝分裂作用。当细胞内活性氧水平升高超过细胞

22、还原能力时，将会对细胞内DNA，蛋白质以及脂质造成损伤。细胞内存在着酶(如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶GPX)以及非酶(如还原性谷胱甘肽GSH)防护机制来清除代谢过程中不断产生的ROS以维持氧化还原平衡。其中，MnSOD被认为是一种比较重要的酶，在细胞抗氧化作用中发挥着重要作用。当细胞缺乏有效的防护时，氧化应激便会促使细胞发生凋亡。MUC1过表达可以通过上调抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD1、SOD2）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX)的表达，使细胞内活性氧水平降低，以抵抗氧化应激诱导的细胞死亡7。另有研究结果8表明MUC1胞质区域可激活FOXO3a，降低细胞内

23、活性氧水平以及氧化应激诱导的死亡反应；下调MUC1可使FOXO3a失活，增加胞内氧化剂水平，提高癌细胞对氧化应激诱导死亡的敏感性。本实验流式及Western-Blot结果表明细胞经GO-201与射线联合作用后，活性氧水平较对照组明显升高，MnSOD表达明显降低。放射生物学研究发现组织在有氧的条件下照射时可产生过氧化物自由基, 后者攻击生物靶分子, 阻止靶分子损伤的修复, 从而提高靶分子对射线的敏感性, 加重机体的放射损伤效应。本实验结合流式及Western-Blot结果推测：GO-201可通过降低MnSOD表达，使细胞内活性氧水平升高，从而增加射线对A549细胞的杀伤力。但不排除GO-201也

24、可通过影响其它几种酶的表达及GSH水平，参与调节细胞内活性氧水平。综上所述抑制MUC1胞内段功能可增加射线对体外培养的人肺腺癌A549细胞的杀伤作用。其机制可能通过下调MnSOD表达，升高细胞内活性氧水平，影响细胞内氧化还原平衡，进而达到放疗增敏作用。至于涉及的具体基因调节过程及信号传导通路需要进一步探讨。本研究需体内实验进一步验证，从而为临床治疗提供一种新的思路。参考文献1 Situ D R, Wang J, Ma Y, et al. Expression and prognostic relevance of MUC1 in stage IB non-small cell lung can

25、cerJ. Med. Oncol., 2011, 28:S596-S604.2 Khodarev N N, Pitroda S P, Beckett M A, et al. MUC1-Induced Transcriptional Programs Associated with Tumorigenesis Predict Outcome in Breast and Lung CancerJ. Cancer Res., 2009, 69(7):2833-2837.3 MacDermed D M, Khodarev N N, Pitroda S P, et al. MUC1-associated

26、 proliferation signature predicts outcomes in lung adenocarcinoma patientsJ. BMC Med. Genomics, 2010, 3.4 Xu,X. et al. MUC1 contributes to BPDE-induced human bronchial epithelial cell transformation through facilitating EGFR activation J. PLoSOne, 2012,7, e33846.5 Akriti Kharbanda, Hasan Rajabi, Cai

27、ning Jin, et al. Breast Cancer Oncogenic MUC1-C Promotes Tamoxifen Resistance in Human J, Mol Cancer Res 2013;11:714-723.6. Xu,X. et al. MUC1 in macrophage: contributions to cigarette smoke-induced lung cancer J. Cancer Res.,2014, 74, 460470.7 Yin L, Li Y Q, Ren J, et al. Human MUC1 carcinoma antigen regulates intracellular oxidant levels and the apoptotic response to oxidative stressJ. J. Biol. Chem., 2003, 278(37):35458-35464.8 Yin L, Huang L, Kufe D. MUC1 oncoprotein activates the FOXO3a transcription