脯氨酸含量的测定

1、植物组织游离脯氨酸含量的测定（一）实验原理      植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。      采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。 （二）实验材料、仪器设备及试剂&

2、#160;1 材料植物叶片     2 仪器设备 分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml) ，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。3 试剂 (1) 3磺基水杨酸溶液 ：万分之一电子天平称取3 g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100 ml蒸馏水中。    (2) 甲苯 (3) 2.5酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4下23天有效

3、（此步骤重要）。 称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液50 ml放入70水浴锅中溶解，冷却。(4) 脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100 ug/ml。再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。  三实验方法1 标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。试管号0123456脯氨酸标准溶液/ml00.20.40.81.21.62水/ml21.61.20.80.40.20冰乙酸/ml2222222茚三酮显

4、色液/ml3333333脯氨酸含量/µg0248121620（2）取出冷却后向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm下比色。 （3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程 。2 样品测定     （1）脯氨酸提取：从-80冰箱中取出样品，放入事先装好液氮的保温桶中。每个样品均取0.2 g左右，分别置于大试管中，加入5 ml 3磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。 （2）取出试管，待

5、冷却至室温后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml显色液，于沸水浴中加热40 min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm下比色）。  （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度 脯氨酸含量的百分数。     脯氨酸g.g-1(干或鲜重)=(C·V)·(a·W)1    式中：C一提取液中脯氨酸浓度，由标准曲线求得：

6、            V  提取液总体积（ml）            A -  测定时所吸取得体积（ml）            W- 样品重（g）数据统计表海拔处理编号吸光度标准曲线斜率稀释倍数提取液中脯

7、氨酸含量C（ug）提取液总体积V（ml）测定时所吸取的体积a（ml）样品重（W）脯氨酸含量 ugg平均值2900CK1 1 11 1 21 1 31 1 4PEG1 2 11 2 21 2 31 2 43000CK2 1 12 1 22 1 32 1 4PEG2 2 12 2 22 2 32 2 43100CK3 1 13 1 23 1 33 1 4PEG3 2 13 2 23 2 33 2 43258CK4 1 14 1 24 1 34 1 4PEG4 2 14 2 24 2 34 2 43600CK5 1 15 1 25 1 35 1 4PEG5 2 15 2 25 2 35 2 43600-1CK6 1 16 1 26 1 36 1 4PEG6 2 16 2 26 2 36 2 43700CK7 1 17 1 27 1 37 1 4PEG7 2 17 2 27 2 37 2 43800CK8 1 18 1 28 1 38 1 4PEG8 2 18 2 28 2 38 2 43900CK9 1 19 1 29 1 39 1 4PEG9 2 19 2 29 2 39 2 44000CK10 1 110 1 210 1 310 1 4PEG10 2 110 2 210