医学专题—细胞破碎汇编课件

1、生物分离(fnl)工程Bioseparation Engineering第三章 细胞破碎第一页，共三十九页。生物分离过程的一般生物分离过程的一般(ybn)流程流程第二页，共三十九页。不同类型的细胞分泌目标不同类型的细胞分泌目标(mbio)产物的类型：产物的类型：n动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌 在培养液中。在培养液中。n植物细胞：多为胞内产物。植物细胞：多为胞内产物。n微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外； 大多数大分子产物和基因重组大多数大分子产物和基因重组(zhn z)产物为产物为 胞内产物，胞

2、内产物，如胰岛素、干扰素、白细如胰岛素、干扰素、白细 胞介素胞介素-2等等均为胞内产物。均为胞内产物。 对于胞内产物，对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。能进一步提取。 第三页，共三十九页。第三章 细胞(xbo)破碎3.1 细胞壁的组成与结构(jigu)3.2 细胞破碎技术的分类3.3 常用破碎技术3.4 破碎率的测定3.5 破碎技术的发展方向第四页，共三十九页。n细胞破碎细胞破碎(p su)（cell rupture）技术是指利用外力破坏）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放细胞膜和细胞壁，使

3、细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。出来的技术。n为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解细胞壁细胞壁的组成和结构。的组成和结构。第五页，共三十九页。3.1 细胞壁的组成(z chn)与结构n微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些外一些(yxi)物质的交换渗透作用；物质的交换渗透作用； 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能。械损伤

4、的功能。n细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。 第六页，共三十九页。3.1 细胞壁的组成(z chn)与结构 革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌 革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌 酵酵 母母 霉霉 菌菌 植物细胞植物细胞壁厚壁厚(nm) 2080 1013 100300 100250 27 m层次层次 单层单层多层多层多层多层多层多层多层多层主要组成主要组成 肽聚糖肽聚糖磷壁酸磷壁酸肽聚糖肽聚糖脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖磷磷 脂脂蛋白质蛋白质 葡聚

5、糖葡聚糖 甘露聚糖甘露聚糖 蛋白质蛋白质 脂脂 类类多聚糖多聚糖脂脂 类类蛋白质蛋白质 纤维素纤维素半纤维素半纤维素果胶物质果胶物质木质素木质素蛋白质蛋白质破碎破碎难易程度难易程度较难破碎较难破碎较易破碎较易破碎较难破碎较难破碎难破碎难破碎很难破碎很难破碎第七页，共三十九页。3.2 细胞破碎技术(jsh)的分类分分 类类破碎原理破碎原理破碎技术举例破碎技术举例机械法机械法固体剪切作用固体剪切作用珠磨法珠磨法 、x-press法法 液体剪切作用液体剪切作用高压匀浆高压匀浆 、超声破碎、超声破碎 非机械法非机械法溶胞作用溶胞作用酶溶法酶溶法 、物理法、物理法、化学法化学法膜失水作用膜失水作用干燥处

6、理干燥处理第八页，共三十九页。第九页，共三十九页。机械机械(jxi)破碎破碎珠磨法挤压(j y)法匀浆法超声法 物理物理(wl)破碎破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂表面活性剂酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。作用，而使细胞破碎。通过细胞本身的酶系或外加酶制通过细胞本身的酶系或外加酶制

7、剂的催化作用，使细胞外层结构剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。受到破坏，而达到细胞破碎。几种细胞破碎方式的比较几种细胞破碎方式的比较第十页，共三十九页。影响破碎影响破碎(p su)(p su)难易程度的重要因素：难易程度的重要因素：n机械机械(jxi)(jxi)法法细胞的大小和形状、细胞的大小和形状、细胞壁厚度细胞壁厚度、聚、聚合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物合物交联程度。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞破碎细胞） n非机械法非机械法细胞壁、膜的组成和结构细胞壁、膜的组成和结构。了解细胞壁的。

8、了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序的顺序 。（。（溶解壁膜上的某些组成溶解壁膜上的某些组成打洞打洞）第十一页，共三十九页。3.3常用破碎(p su)技术3.3.1珠磨法（珠磨法（bead millbead mill）实验常用实验常用 n工作原理：工作原理：细胞悬浮液与极细的珠子细胞悬浮液与极细的珠子( (玻璃、石英砂、氧玻璃、石英砂、氧化铝等研磨剂，直径化铝等研磨剂，直径1mm)1mm)一起一起快速搅拌或快速搅拌或研磨研磨，研磨，研磨剂

9、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎剂珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎(p (p su)su)，释放出内含物。，释放出内含物。n实验室规模：实验室规模：MickleMickle高速组织捣碎机、高速组织捣碎机、BraunBraun匀浆器；匀浆器；n中试规模：胶质磨；中试规模：胶质磨；n工业规模：高速珠磨机工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)(High-speed bead mill)。第十二页，共三十九页。第十三页，共三十九页。3.3.1 珠磨法n细胞破碎率可用一级反应动力学表示细胞破碎率可用一级反应动力学表示 ： 间歇操作：间歇操作： ln1/(1-

10、ln1/(1-R R)=)=KtKt 连续操作：连续操作： ln1/(1-ln1/(1-R R)=)=KK 其中其中 = =V V/ /F F 式中：式中： R R破碎率（破碎率（g/gg/g） K K反应速率常数反应速率常数(chngsh)(chngsh)(1/s)(1/s) t t破碎时间破碎时间(s)(s) 平均停留时间平均停留时间(s)(s) V V破碎室悬浮液体积（破碎室悬浮液体积（L L） F F进料速率进料速率(L/s) (L/s) 第十四页，共三十九页。操作条件操作条件(tiojin)的选择：的选择：n珠体大小珠体大小根据细胞大小、浓度根据细胞大小、浓度(nngd)(nngd)

11、以及连续操作时不使珠体带出以及连续操作时不使珠体带出来选择。来选择。n珠体装量珠体装量装量少时，细胞不易装量少时，细胞不易破碎；装量大时，能量消耗大，研破碎；装量大时，能量消耗大，研磨室热扩散性能降低，引起温度升磨室热扩散性能降低，引起温度升高。高。n温度温度温度高时细胞较易破碎，但要温度高时细胞较易破碎，但要考虑目的产物不受破坏。一般温度控制考虑目的产物不受破坏。一般温度控制在在5 54040内时影响较小。内时影响较小。搅拌转速搅拌转速(zhu(zhu n s)n s)过过高将使能量消耗大增，而高将使能量消耗大增，而破碎率破碎率上升不明显上升不明显。Rn能耗第十五页，共三十九页。破碎率的控制

12、破碎率的控制(kngzh)：n破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升 ；n高破碎率高破碎率产生较多的热能，增大产生较多的热能，增大(zn d)(zn d)了冷却控温的难度；了冷却控温的难度；n破碎率破碎率越越高，细胞碎片高，细胞碎片越越小，分离碎片小，分离碎片越越困难困难；n高破碎率下，高破碎率下，目的产物的失活损失增加。目的产物的失活损失增加。 珠磨法的珠磨法的破碎率一般控制在破碎率一般控制在80%80%以下以下，并兼顾下游过程。，并兼顾下游过程。 第十六页，共三十九页。3.3.2 高压匀浆法( (High-pressure homogenization

13、) ) 大规模细胞破碎的常用大规模细胞破碎的常用(chn yn)(chn yn)方法方法 n工作工作(gngzu)(gngzu)原理：利用高压使原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。在高压匀浆器中，细胞破裂。在高压匀浆器中，高压室的压力高达几百个大气高压室的压力高达几百个大气压，细胞悬浮液自高压室针形压，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，速度可达每秒几百阀喷出时，速度可达每秒几百米。米。第十七页，共三十九页。破碎破碎(p su)的动力学方程：的动力学方程：式中：式中：KT与温度等有关的破碎常数与温度等有关

14、的破碎常数 N悬浮液通过匀浆器的次数悬浮液通过匀浆器的次数(csh) P操作压力操作压力 aa微生物种类常数，对于酵母菌微生物种类常数，对于酵母菌a a值可取值可取2.22.2 aTNPKR)1/(1ln第十八页，共三十九页。破碎破碎(p su)压力的选择：压力的选择：n增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大的磨损较大(jio d)(jio d)，此外当压力超过一定值，此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。后，破碎率的增加很慢。n在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通

15、常采用的压力为555570MPa70MPa。 第十九页，共三十九页。 破碎一般规律：破碎一般规律：（1）酵母较细菌难破碎；酵母较细菌难破碎；（2 2）处于静止状态的细胞较处于快速生长）处于静止状态的细胞较处于快速生长(shngzhng)(shngzhng)状态的细胞状态的细胞难破碎；难破碎；（3 3）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的）在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。细胞较难破碎。n不宜采用高压匀浆法破碎不宜采用高压匀浆法破碎(p su)(p su)的有：的有：（1 1）易造成堵塞的团状或丝状真菌，）易造成堵塞的团状或丝状真菌，（2 2）较小的革

16、兰氏阳性菌，）较小的革兰氏阳性菌，（3 3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体）某些质地坚硬的亚细胞如包含体（inclusion body）。 第二十页，共三十九页。3.3.3 超声破碎超声破碎(p su)(p su)（UltrasonicationUltrasonication） 主要用于实验室主要用于实验室 n破碎机理：可能与空化现象（破碎机理：可能与空化现象（Cavitation Cavitation phenomenaphenomena）引起的冲击波和剪切作用）引起的冲击波和剪切作用(zuyng)(zuyng)有关。有关。 n通常采用的超声破碎机在通常采用的超声破碎机在151525KHz25

17、KHz的频率的频率下操作。下操作。n超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。细胞浓度及菌种类型等因素有关。 第二十一页，共三十九页。超声破碎超声破碎(p su)(p su)的适用性：的适用性：n细胞种类：细胞种类：杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细胞比革杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细胞比革兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。兰氏阳性细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。 n超声波振荡易引起超声波振荡易引起温度的剧烈上升温度的剧烈上升，操作时常在冷却条，操作时常在冷却条件下进行。小规模实验常采用间歇操作，大规模生产受限件下进行。

18、小规模实验常采用间歇操作，大规模生产受限制。制。n超声波产生的化学自由基团能使超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质某些敏感性活性物质失活失活，因而，因而(yn r)(yn r)有一定的局限性。有一定的局限性。 第二十二页，共三十九页。3.3.4 酶溶法酶溶法研究较广的一种研究较广的一种(y zhn)方法方法n原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而原理：利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到达到(d do)破壁的目的。破壁的目的。n自溶法自溶法控制一定条件，诱发细胞自溶酶使细胞破碎。控制一定条件，诱发细胞自溶酶使细胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。自溶法常采用加热法

19、或干燥法。 n外加酶法外加酶法根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。根据细胞壁膜的结构及组成选择合适的酶。 细菌大多用细菌大多用溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme) 酵母菌常用溶酶有：酵母菌常用溶酶有： -1,3-1,3-葡聚糖酶葡聚糖酶(glucanase)(glucanase)、-1,6-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶(protease)(protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、糖苷酶、糖苷酶(glycosidase)(glycosidase)、肽键内切酶、肽键内切酶(endopeptidase)(endopeptida

20、se)、壳多糖酶等、壳多糖酶等 。第二十三页，共三十九页。酶溶法的特点酶溶法的特点(tdin)（外加酶）：（外加酶）：（1）酶溶法需要特定的反应条件。）酶溶法需要特定的反应条件。（2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和化学酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应的次序。 （3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件温和酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件温和(wnh)(wnh)，核酸泄出量少，细胞外形完整。，核酸泄出量少，细胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法通用性差，酶

21、溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存在产物抑制，在溶酶系且不易确定最佳的溶解条件；三是存在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用。统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用。 第二十四页，共三十九页。3.3.5 化学化学(huxu)渗透法渗透法n某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透透性（渗透(shntu)(shntu)性），从而使胞内物质有性），从而使胞内物质有选择地渗透选择地渗透(shntu)(shntu)出来，这种处理方式称为出来，这种处理方式称为化学渗透化学渗透(shntu)(shntu)法法(Che

22、mical permeation)(Chemical permeation)。n常用化学试剂有：有机溶剂、变性剂、表常用化学试剂有：有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等。面活性剂、抗生素、金属螯合剂等。第二十五页，共三十九页。作用作用(zuyng)原理：原理：n化学化学(huxu)(huxu)渗透法取决于化学渗透法取决于化学(huxu)(huxu)试剂的类型以及细胞壁膜的试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学结构与组成，不同化学(huxu)(huxu)试剂作用的部位和方式有所不同，试剂作用的部位和方式有所不同，现举例如下。现举例如下。（1 1）表面活性物质：）表面活性物质：

23、可促使细胞某些组分溶解可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有，其增溶作用有助于细胞的破碎。如助于细胞的破碎。如TritonX-100TritonX-100能结合并溶解磷脂，破坏内能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。膜的磷脂双分子层，从而使某些胞内物质释放出来。（2 2）EDTAEDTA螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌（如螯合剂：可用于处理革兰氏阴性菌（如E.coliE.coli）, ,它对其它对其细胞外层膜有破坏作用细胞外层膜有破坏作用。 第二十六页，共三十九页。（3 3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。（4 4）变性剂：）变性剂

24、：如如盐酸胍盐酸胍(Guanidin HCl)(Guanidin HCl)和脲（和脲（UreaUrea）与）与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而(cng (cng r)r)使疏水性化合物溶于水溶液。使疏水性化合物溶于水溶液。各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。能有效地提高胞内物质的释放率。例：例：单独用单独用0.1mol/L0.1mol/L盐酸胍处理盐酸胍处理E.coliE.coli仅释放约仅释放约1%1%的蛋白质的蛋白质 0.5% TritonX-1

25、000.5% TritonX-100处理蛋白质释放率为处理蛋白质释放率为4%4% 二者合用，蛋白质释放率可达二者合用，蛋白质释放率可达53%53%左右左右 第二十七页，共三十九页。化学化学(huxu)(huxu)渗透法的优点：渗透法的优点： 对产物释放具有一定选择性。可使一些较对产物释放具有一定选择性。可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。胞内。细胞细胞(xbo)(xbo)外形保持完整，碎片少，浆液粘度外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。低，易于固液

26、分离和进一步提取。 第二十八页，共三十九页。化学化学(huxu)(huxu)渗透法的缺点渗透法的缺点 ：（1）通用性差，某种试剂只能作用于某些特通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。定类型的细胞。 （2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过不超过50%50%。 （3）有些有些(yuxi)(yuxi)化学试剂有毒性化学试剂有毒性 。第二十九页，共三十九页。3.3.6 选择破碎方法选择破碎方法(fngf)的依据的依据（1）细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用性强，）细胞处理量：大规模生产多采用机械法（通用性强，破碎效率高），实验室规模多选用非机械

27、法（选择性好，破碎效率高），实验室规模多选用非机械法（选择性好，固液易分离）。固液易分离）。（2）细胞壁的强度与结构：见）细胞壁的强度与结构：见3.2。（3）目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产品，）目标产物对破碎条件的敏感性：对活性物质产品，要兼顾效率与稳定性。要兼顾效率与稳定性。（4）破碎程度：操作条件要兼顾产物释放）破碎程度：操作条件要兼顾产物释放(shfng)率、能耗和率、能耗和便于后提取。便于后提取。第三十页，共三十九页。3.4 破碎率的测定(cdng)（1 1）直接测定法）直接测定法利用显微镜或电子微粒计数器直接利用显微镜或电子微粒计数器直接计数破碎前后的细胞数计数破碎前后的细

28、胞数。（仅适合于机械法）。（仅适合于机械法）（2 2）目的产物测定法目的产物测定法 通过测定破碎液中目的产物的通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。释放量来估算破碎率。（多用于生产，必须有（多用于生产，必须有100%100%破碎率破碎率作作标准数值比较标准数值比较）（3 3）导电率测定法导电率测定法 细胞破碎后，大量带电荷的内含细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。（物被释放到水相，使导电率上升。（是一种快速是一种快速(kui s)(kui s)测测定法，定法，应预先采用其他方法制定标准曲线应预先采用其他方法制定标准曲线 ） 第三十一页，共三十九页。3.5 破碎技术

29、(jsh)的发展方向3.5.1 多种破碎方法多种破碎方法(fngf)相结合相结合 机械法与非机械法机械法与非机械法 化学法与酶法化学法与酶法 多种化学试剂处理多种化学试剂处理 多种酶制剂处理多种酶制剂处理第三十二页，共三十九页。机械机械(jxi)法与非机械法与非机械(jxi)法：法： 化学法与酶法取决于细胞壁膜的化学组成，机械法化学法与酶法取决于细胞壁膜的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然的机械强度，组成的变化必然(brn)(brn)影响到强度的差异，影响到强度的差异，这就是化学法与机械法相

30、结合的原理。这就是化学法与机械法相结合的原理。细胞细胞酶法或化学法处理酶法或化学法处理破坏细胞壁某些物质组成破坏细胞壁某些物质组成壁的机械壁的机械强度强度机械法处理机械法处理细胞破碎率细胞破碎率 第三十三页，共三十九页。例：面包酵母细胞的破碎例：面包酵母细胞的破碎 用溶解酶（用溶解酶（Zymolyase）预处理，然）预处理，然后在后在95MPa压力压力(yl)下高压匀浆下高压匀浆4次，总破碎次，总破碎率接近率接近100%。 而单独用而单独用95MPa压力高压匀浆压力高压匀浆4次，破次，破碎率只有碎率只有32%。第三十四页，共三十九页。3.5.2 与上游与上游(shngyu)相结合相结合（1）寄主细胞的选择）寄主细胞的选择：选择较易破壁的菌种作为寄主细选择较易破壁的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌。胞，如革兰氏阴性细菌。 （2）培养过程控制培养过程控制 ：在发酵培养过