T4DNA连接酶EL0011Thermoscientific

1、T4DNALigaseThermoscientific#EL0011产品信息特点快速-室温下 10 分钟内完成粘末端的连接反应。该酶在 Fermentas 公司限制酶、PCRRT 缓冲液(添加 ATP)中活性。配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。应用克隆酶切产生的DNA片段。克隆PCR产物。连接双链寡聚核甘酸街头或连接物。定点诱变。扩增片段长度多态性(AFLP)。连接酶介导的RNA检测(3)。双链DNA,RNA或DNA/RNA复合体中缺口的修复。线性DNA自身环化。说明T4?DNALigase 催化双链 DNA 或 RNA 中毗邻的 5-磷酸基团和 3-羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可

2、以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 复合体中的单链切口，连接 DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性(1,2)。T4DNALigase 需要辅因子 ATP。浓度1Weissu/M=200CEU*/日5Weissu/M=1000CEU*/日30Weissu/M=6000CEU*/日*一个粘性末端连接单位的是指在 16C、30 分钟内 50%连接 Hindlll 酶切的 lamdaDNA 产物所需要的酶的量。来源含有 T4 噬菌体克隆基因 30 的大肠杆菌。分子量55.3kDa,单体。活性单位定义1 个活性单位是指在 ATP-PPi 交换反应中，37C、20 分钟内将 1nm

3、ol32PPi转换为 Norit 可吸收形式所需的酶量(Weiss 单位*(4)。酶活性分析混合物：66mMTris-HCl(pH7.6),6.6mMMgCl2,0.066mMATP,10mMDTT,3.3?M32PPi.*1 个 Weiss 单位相当于约 200 个粘性末端连接单位。1 个粘性末端连接单位：20?日反应体系(50mMTris-HCl?(pH?7.5),10mM 埔 gCl2,10mM 领 TT,1mMATP,25闻/ml 燃 SA,0.12M(300?闻/ml)的 5-DNA 末端)中，在 16C、30 分钟内 50%连接 HindIII 酶切的LambdaDNA 产物所需要

4、的酶量。保存缓冲液保存缓冲液组分：20mMTris-HCl(pH7.5),1mMDTT,50mMKCl,0.1mMEDTA 和 50%(v/v)甘油。10XT4DNALigase 缓冲液(#B69)400mMTris-HCl,100mMMgCl2,100mMDTT,5mMATP(pH7.8,25C)。质量控制相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。功能检测：粘性末端或平末端 DNA 的连接能力。抑制与失活抑制剂：当反应体系中 NaCl 或 KCl 的浓度超过 200?mM 时，可强烈抑制 T4DNALigase 活性。失活：65C 加热 10 分钟或者 70C 加热 5

5、 分钟。备注聚乙二醇(PEG)极大地增加平末端连接效率(5)。反应体系中的 PEG4000 的建议浓度为 5%(w/v)。T4DNALigase 与 DNA 结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与 Fermentas公司 6XDNALoadingDye&SDS 溶液(#R1151)混合； 70C 加热 5 分钟或 65C 加热 10 分钟后冰浴保存。转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的 10%。电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的 T4DNALigase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。操作

6、手册DNA 插入片段与载体 DNA 连接1.反应体系配方如下：组分粘性末端连接平末端连接线性载体 DNA20-100ng插入片段 DNA与载体的摩尔比为 1:1 到 5:110XT4DNALigasebuffer2pl50%PEG4000 溶液*-2plT4DNALigase0.24(1u)1pl(5u)水，无核酸酶(#R0581)至 20M*50%PEG4000 溶液随 FermentasT4DNALigase 配套提供(#EL0335,#EL0334)。2 .粘性末端：22C 孵育 10 分钟；平末端：22C 孵育 1 小时。3 .65C 热失活 10 分钟。4.转化：每 50J 化学感受

7、态细胞使用 5J 连接产物；每 50M 电转感受态细胞使用 1-2M 连接产物备注:如需增加转化子数量：如果连接产物的产量不够，建议 4C 孵育连接过夜。采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连接产物建议采用电转化方法。线性 DNA 自身环化1.反应体系配方如下：线性载体 DNA10-50ng10XT4DNALigasebuffer5plT4DNALigase1pl(5u)水，无核酸酶(#R0581)至 50M总体积50pl2.充分混匀后短暂离心，22C 孵育 1 小时。3.65C 热失活 10 分钟。4.取大约 5M 连接产物转化 504 化学感受态细胞。备注采用氯仿抽提替换热失活方法，平末端连

8、接产物建议采用电转化方法。接头连接双链寡核甘酸接头常用于产生插入片段中没有的兼容性突出末端。接头含有限制酶识别位点，与目标片段连接后酶切可产生与克隆载体匹配的粘性末端。此外接头也可直接带有匹配的粘性末端，与克隆载体直接连接，无需额外操作。1 .根据应用不同，准备下列的反应体系：组分连接，用于后续酶切仅仅连接线性 DNA5gl(100-500ng)磷酸化接头 51(1-210XT4DNALigasebuffer-2pl限制酶用 10Xbuffer21-ATP,10mM*1M(终浓度 0.5mM)-总体积20gl20gl50%PEG4000 溶液*21T4DNALigase(#EL0334)或(#

9、EL0335)0.4M 或 2M(2u)水，无核酸酶(#R0581)至 20gl总体积至 201至 20M1 混合 10pl100mMATP 溶液(#R0441)和 90M 水(无核酸酶，#R0581)制备 10mMATP 溶液2 *50%PEG4000 溶液随 FermentasT4DNALigase 配套提供(#EL0335,#EL0334)。2,充分混匀后短暂离心，22C 孵育 1 小时。3.65C 热失活 10 分钟。备注连接产物酶切前无需纯化，可将限制酶直接加入连接反应混合物中。T4DNALigase 活性分析对照反应连接酶失活或样本 DNA 中的杂质会导致连接失败。推荐采用对照 D

10、NA(如：LambdaDNA/HindIIIDNAMarker(#SM0101)的连接实验分析 T4DNAligase 的活性。1,对照连接混合物准备：LambdaDNA/HindIIIDNAMarker(#SM0101)1pl(0,5闻)10XT4DNALigaseBuffer2plT4DNALigase1u水，无核酸酶(#R0581)至 20M总体积至 20M2,充分混匀后短暂离心，22C 孵育 10 分钟3,制备上样混合物：连接产物10pl6XDNALoadingDye&SDSSolution21图 1,对照实当评价 T4DNALigase 活性。1-LambdaDNA/Hind

11、IIIfragments,未连接2 连接后的 LambdaDNA/HindIII结果解释出现更高分子量条带且低分子量条带变弱，表明连接酶有活性。连接后条带不发生变化，说明连接酶失活。参考文献：|Rossi,R.,etal.,FunctionalcharacterizationoftheT4DNALigase:anewinsightintothemechanismofaction,NucleicAcidsRes.,25,2106-2113,1997.、Cherepanov,A.V.,etal.,BindingofnucleotidesbyT4DNALigaseandT4RNALigase:opticalabsorbanceandfluorescencestudies,Biophys.J.,81,3545-3559,2001.；Nilsson,M.,etal.,RNA-templatedDNAligationfortranscriptanalysis,NucleicAcidsRes.,29,578-581,2001.4Weiss,B.,etal.,Enzymaticbreakageandjoiningofdeoxyribonucleicacid,J.Biol.Chem.,243,4543-4555,1968.、Pheiff