沙眼衣原体核酸扩增荧光检测-检验科PCR室作业书

1、【实用】检验科SO我件沙眼衣原体核酸扩增荧光检测目的：保证CTDNA佥测结果准确、可靠。适用范围：CTDNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为分泌物。负责人：操作人：原理：本试剂盒用一对沙眼衣原体特异引物和一条沙眼衣原体特异性 荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核甘酸单 体（dNTP§等成分，再用PCR#外扩增法检测沙眼衣原体 DNA。 性能参数：检出低值 25基因拷贝/ml。标本要求：（1）标本类型：分泌物。（2）标本采集：见标本采集手册。（3）标本储存和运输：室温放置不超过 8小时，4-8 C不超过72小 时，-20C保存期6个月，应避免反复冻融。室温

2、运输。（4）标本拒收状态：细菌污染标本不能作测定。容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌试管。所需设备：ABIGeneAmp5700台式高速离心机、混匀器、冰箱（4C、-20C）、生物安全柜、紫外灯试剂：DNA提取液（ 500p l/管）2管；CT-PC反应液（未贴标签管） 20管；阳性定量质控标准品（1X108基因拷贝/ml） （50 口/管）1管; 阴性质控品（250 口/管）1管。校准程序（计量学溯源性）：送XXX市计量检测所校准。程序步骤：11.1 标本采集、保存和运送男性：取尿道分泌物或细小棉拭子伸入快尿道约24cm,略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将分泌物或棉拭子置入无菌玻璃管，用无

3、 菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。女性：阴道一用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物， 再用无菌棉拭 子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭采取宫颈分泌物， 将棉拭子置入 无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。尿道一用无菌生理盐水棉球洗净尿道口， 再用无菌棉拭子插入尿道约 2cm,略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将棉拭子置入无菌玻璃 管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。标本可立即用于测试，也可保存于-20C待测，存期为6个月。标 本运送应米用0 C冰壶。11.2 标本及对照标准品的处理标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中（如分泌物较多，只取 0.2ml

4、） 12000rpm离心5分钟. 沉淀加无菌生理盐水1ml打匀,12000rpm离心5分钟，再重复洗涤一次. 沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀，（提取液内含不溶于水的物质， 取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取 或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去 一截。）沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4c静置6-8小时 以保证充分裂解。12, 000rpm离心2分钟，取上清液2ul做PCR反 应。另取阴阳性质控标准品各 50ul加等量DNA提取液打匀，沸水浴 10分钟后同上处理。11.3 GeneAmp5700操作取单管单人份PCR5应管若干管

5、，直接加入处理后样品（或阴阳性质 控标准品）2ul, 6000rpm离心数秒。将各反应管放入 PCR仪，按下 列条件扩增：ABIGeneAmp5700的循环条件：93 c 2分钟预变性，然后按93 C 45秒 55c60秒，先做10个循环，最后93C 30秒55c 45秒，做30个循 环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。11.4 结果分析条件的设定ABIGeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节 baseline 的 start 值（24）,stop 值（79）以及 Threshold 值,使阴性质控品Ct值为30,临界阳性质控标准品Ct值为2224,强阳 性质控标准品Ct值为1820最后记录仪器自动分析计算出的 Ct值. 质量控制程序：阴性质控品：全部阴性阳性定量标准品：全部阳性I r | 三 0.97（correlation 数值介于-0.97-1）;108 至 104 基因拷贝 /ml 的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于士300%干扰：标本污染。生物参考区间：正常人样本为阴性或 0基因拷贝/ml。患者检验结果的可报告区间：Ct值40,实验1例:的CTDNA含量（基 因拷贝数/ml） =M; Ct值=40,样品CTDNA含量25基因拷贝/ml