第七章酶的非水相催化第八章酶定向进化

1、Chapter 7 Enzymatic Catalysis in Non-aqueous System酶的非水相催化酶的非水相催化Contents of Chapter 71、酶催化反应的介质2、有机介质反应体系 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 GoGoGoGo5、酶非水相催化的应用 Go第一节第一节 酶催化反应的介质酶催化反应的介质水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶

2、或不溶。在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行

3、催化反应体系中进行催化反应。酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型1 1、有机介质中的酶催化、有机介质中的酶催化u 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。溶剂中进行的催化反应。u 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶催化作用。u 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型2 2

4、、气相介质中的酶催化、气相介质中的酶催化u酶在气相介质中进行的催化反应。酶在气相介质中进行的催化反应。u适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。酶催化反应。 u由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。不同特点。3 3、超临界介质中的酶催化、超临界介质中的酶催化u酶在超临界流体中进行的催化反应。酶在超临界流体中进行的催化反应。u超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点超临界流体是指温度和压力超过某物

5、质超临界点的流体。的流体。 酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型4 4、离子液介质中的酶催化、离子液介质中的酶催化u酶在离子液中进行的催化作用。酶在离子液中进行的催化作用。u离子液离子液（ionic liquidsionic liquids）是由有机阳离子与有机是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。点盐类，挥发性低、稳定性好。u酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著

6、特点。域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。 第二节第二节 有机介质反应体系有机介质反应体系 1 1、非极性有机溶剂、非极性有机溶剂酶悬浮体系酶悬浮体系( (微水介质体系微水介质体系) )用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性合水以保持酶的催化活性( (含水量一般小于含水量一般小于2%)2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。态，或者吸附在固体载体表面上。研究最多研究最多2 2、与水

7、互溶的有机溶剂、与水互溶的有机溶剂组成的均一组成的均一体系体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。底物和产物都能溶解在这种体系中。 3 3、与水不溶性有机溶剂、与水不溶性有机溶剂组成的组成的两相两相/ /多相体多相体系系 由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂剂( (高脂溶性高脂溶性) )相所组成的两相体系。相所组成的两相体系。不管采用何种有机介质反应体系，酶催不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化

8、反应有显著的影响的水。它们都对催化反应有显著的影响水水对有机介质中酶催化的影响对有机介质中酶催化的影响酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是水是不可缺少的成分之一不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的有机介质中的水含量多少对酶的空间构象空间构象、酶的酶的催化活性催化活性、酶的、酶的稳定性稳定性、酶的、酶的催化反应催化反应速度速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度底物

9、和反应产物的溶解度有关。有关。 水水对有机介质中酶催化的影响对有机介质中酶催化的影响酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（水（essential wateressential water）。有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著有机

10、介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在影响。存在最适水含量最适水含量。表征必需水作用的参数表征必需水作用的参数热力学热力学水活度水活度即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压即在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反与相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。溶剂无关。有机溶剂有机溶剂对有机介质中酶催化对有机介质中酶催化的影响的影响常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。季丁

11、醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。 在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别整性的情况也有所差别。 有机溶剂有机溶剂对有机介质中酶催化对有机介质中酶催化的影响的影响极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙

12、醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性从而降低酶的催化活性, ,甚至引起酶的变性失活。甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性性。 有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响影响底物和产物的分配底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。，

13、从而影响酶的催化反应。2 有机溶剂影响酶催化的方式有机溶剂影响酶催化的方式 （1） 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活起抑制或失活A 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度增大酶反应的活化能来降低酶反应速度B 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。氢键，使酶活性下降。C 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。响失活。 2 有机溶剂影响酶催化的方式有机溶剂影响酶催化的方式（2） 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活（3） 有机溶剂直接与酶附

14、近的必需水相互作用。极性系数lgP：即一种溶剂在正辛烷/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。第三节第三节 酶在有机介质中的酶在有机介质中的催化特性催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。不同的催化特性。热稳定性热稳定性底物专一性底物专一性pH值特性值特性对映体选择性对映体选择性区域选择性区域选择性

15、键选择性键选择性第三节第三节 酶在有机介质中的酶在有机介质中的催化特性催化特性 一、热稳定性一、热稳定性例：丹麦例：丹麦Nove公司生产的脂肪酶公司生产的脂肪酶Lipozyme TM，在水溶液中，在水溶液中60保温保温1小时后剩余的酶活小时后剩余的酶活只有只有10%，而在橄榄油中同样条件下脂肪酶的，而在橄榄油中同样条件下脂肪酶的剩余酶活仍近剩余酶活仍近100%。 60对乌桕脂和硬脂酸对乌桕脂和硬脂酸甲酯的转化反应甲酯的转化反应24小时后，酶仍保持小时后，酶仍保持82%。在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范水量密切相关；一般

16、在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。酶在有机介质与水溶液中的热稳定性酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶酶 介质条件介质条件 热稳定性热稳定性猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯水，水， pH7.0pH7.0T T1/21/2 26 h 26 hT T1/21/2 2 min 2 min酵母脂肪酶酵母脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯/ /庚醇庚醇水，水，pH7.0pH7.0T T1/21/2 =1.5 h =1.5 hT T1/21/2 2 min 2 min脂蛋

17、白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯，甲苯，9090，400 h400 h活力剩余活力剩余4040胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100100水，水，pH 8.0, 55pH 8.0, 55T T1/2 1/2 = 80 min= 80 minT T1/21/2 = 15 min = 15 min枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶正辛烷，正辛烷，110110T T1/21/2 = 80 min = 80 min核糖核酸酶核糖核酸酶壬烷，壬烷，110110，6 h6 h水，水，pH 8.0, 90pH 8.0, 90活力剩余活力剩余9595T T1/21/2 10 min 24 h 24 hT T1/2

18、1/2 10 min 10 min限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （Hind Hind ）正庚烷，正庚烷，5555，30d30d活力不降低活力不降低-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶2-2-丙醇，丙醇，5050，30 h30 h活力剩余活力剩余8080溶菌酶溶菌酶环己烷，环己烷，110110水水T T1/21/2 =140 min =140 minT T1/21/2 = 10 min = 10 min二、专一性二、专一性某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。 酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶酶在有

19、机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性刚性”特特点。点。 因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。特性成为可能。 例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性、立体选择性和手性选择性等。专一性、立体选择性和手性选择性等。有机介质酶催化反应的优点有机介质酶催化反应的优点 由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关，由于引起酶变性的许多因素都与水的

20、存在有关，因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。 由于有机溶剂的存在，水量减少，大大降低了由于有机溶剂的存在，水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。的消旋化和酰基转移等。 在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程，提高回收率。的萃取分离过程，提高回收率。有机介质酶催化反应的优点有机介质酶催化反应的优点第四节第四节 有机介质中酶催化反应的条件有机介质中酶催化反应的条件及其控制及其控制 酶在有机介质中可以催化多种反应

21、，主酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：要包括：合成反应、转移反应、醇解反合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应应、裂合反应等。等。水含量水含量酶的种类和浓度酶的种类和浓度底物的种类和浓度底物的种类和浓度有机溶剂的种类有机溶剂的种类温度温度pHpH有机介质中酶催化反应的条件有机介质中酶催化反应的条件一、 水含量1 影响酶反应体系中需水量的因素影响酶反应体系中需水量的因素a不同酶需水量不同不同酶需水量不同b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强，需水量越少溶剂疏水性越强，需水

22、量越少二、二、 酶的选择酶的选择1、 酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶，过氧化物酶等。2酶形式的选择酶形式的选择（1）酶粉：例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。（） 化学修饰酶：例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。（） 固定化酶：把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。（） 固定化酶：三、三、 溶剂及反应体系的选择溶剂及反应体系的选择水溶性有机溶剂：水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇

23、、正丁醇、甘油、丙酮等。水不溶性的有：水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等。第五节第五节 酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用 酶酶 催化反应催化反应 应用应用 脂肪酶脂肪酶 肽合成肽合成 青霉素青霉素G G前体肽合成前体肽合成 酯合成酯合成 醇与有机酸合成酯类醇与有机酸合成酯类 转酯转酯 各种酯类生产各种酯类生产 聚合聚合 二酯的选择性聚合二酯的选择性聚合 酰基化酰基化 甘醇的酰基化甘醇的酰基化蛋白酶蛋白酶 肽合成肽合成 合成多肽合成多肽 酰基化酰基化 糖类酰基化糖类酰基化羟基化酶羟基化酶 氧化氧化 甾体转化甾体转化过氧化物酶过氧化物酶 聚合聚合 酚类、胺

24、类化合物的酚类、胺类化合物的聚合聚合多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化氧化 芳香化合物的羟基化芳香化合物的羟基化 胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶 氧化氧化 胆固醇测定胆固醇测定醇脱氢酶醇脱氢酶 酯化酯化 有机硅醇的酯化有机硅醇的酯化手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 1992年，美国年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。 许多国家和地区也都制定了有关手性药物的政策和许多国家和地区也都制定了有

25、关手性药物的政策和法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。法规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应用。 目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。对映体药物占绝大多数。 手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物两种异构体化合物1、 手性药物两种对映体的药效差异手性药物两种对映体的药效差异一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有毒副作用一种有显著疗效，另一种有毒副作用两种对映体的

26、药效相反两种对映体的药效相反两种对映体具有各自不同的药效两种对映体具有各自不同的药效两种消旋体的作用具有互补性两种消旋体的作用具有互补性手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 药物名称药物名称有效对映体的作用有效对映体的作用另一种对映体的作用另一种对映体的作用普萘洛尔普萘洛尔萘普生萘普生青霉素胺青霉素胺羟基苯哌嗪羟基苯哌嗪反应停反应停酮基布洛芬酮基布洛芬喘速宁喘速宁乙胺丁醇乙胺丁醇萘必洛尔萘必洛尔S S构型，治疗心脏病构型，治疗心脏病,-,-受体阻断剂受体阻断剂S S构型，消炎、解热、镇痛构型，消炎、解热、镇痛S S构型，抗关节炎构型，抗关节炎S S构型，镇咳构型，镇咳S S

27、构型，镇静剂构型，镇静剂S S构型，消炎构型，消炎S S构型，扩张支气管构型，扩张支气管S,SS,S构型，抗结核病构型，抗结核病右旋体，治疗高血压右旋体，治疗高血压,-,-受体阻断剂受体阻断剂R R构型，钠通道阻滞剂构型，钠通道阻滞剂R R构型，疗效很弱构型，疗效很弱R R构型，突变剂构型，突变剂R R构型，有神经毒性构型，有神经毒性R R构型，致畸胎构型，致畸胎R R构型，防治牙周病构型，防治牙周病R R构型，抑制血小板凝集构型，抑制血小板凝集R,RR,R构型，致失明构型，致失明左旋体，舒张血管左旋体，舒张血管二、二、 手性高分子聚合物的制备手性高分子聚合物的制备 可生物降解的聚酯的合成可生

28、物降解的聚酯的合成 糖脂的合成糖脂的合成脂肪酶脂肪酶-位置选择性酯化反应位置选择性酯化反应OCH2OHOHOHOHOH+RCH2COOH吡啶DMFOCH2OHOHOHOHRCH2COO葡萄糖苷葡萄糖苷-6-O-6-O-酰基衍生物是一种可生物降解的酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷非离子表面活性剂，它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到：三、三、 酚树脂的合成酚树脂的合成例例辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚介质体系中，可以催化苯酚

29、等酚类物质聚合，生成酚类聚合物合，生成酚类聚合物四、四、 导电有机聚合物的合成导电有机聚合物的合成例例辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。苯胺聚合生成聚苯胺。 聚苯胺聚苯胺-导电装置导电装置五、五、 发光有机聚合物的合成发光有机聚合物的合成例例辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。制成二极管，可以发出蓝光。六、六、 食品添加剂的生产食品添加剂的生产利用芳香醛脱氢酶生成香兰素利用芳香醛脱氢酶生成香兰素七、生物柴油七、生物柴油生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。作为柴油发动机的