RealtimePCR操作步骤：从采样到数据处理

1、RealtimePCR操作步骤：从采样到数据处理1 .米样：1.11.1 采样前的准备：DEPC 水，灭菌手术刀剪，75%酒精，2mL 无 RNA 酶离心管，2 个盛有 DEPC 水的烧杯，一个用于冲洗样品，一个用于放置手术刀剪，以减少外界污染。1.21.2 采样过程中的注意事项：采样人员需带好口罩和手套，并且尽量少讲话。当鸡放血致死后，立即解剖，并优先取 RNA 试验用样品。取样量约 100mg 左右（根据 RNA 提取方法不同可改变取样量），尽量保证每管取样大小和部位接近一致（可事先取些样品，有个大概的标准即可）。RNA 样品采集于离心管中，立即投入液氮（或者 RNA 保存液中）冻存，最后

2、统一转入-70C 冰箱。根据实验条件选择 RNA 样品的保存方式，优先选择液氮保存。建议：如果直接投入液氮保存，离心管盖子要盖严，以免液氮渗入管中，导致离心管在转入-70C冰箱时管盖崩开使样品损失。2 .总 RNA 提取提取组织和细胞总 RNA 推荐使用 Trizol 法。2.12.1 TrizolTrizol 提取总 RNARNA 的操作步骤以下操作需在超净台中进行，超净台使用前需用 75%酒精擦拭台面，紫外灯照射半小时后，打开风机排除臭氧，减少对实验人员的伤害。此外，要提前制冰备用。每 50-100mg 样品加 1mlTrizol,使用高通量研磨仪研磨 30s。研磨后样品放置 5min,4

3、C12000g 离心 10min,上清液转移到另一个 1.5ml 无 RNA 酶离心管中（已冰上预冷）。加入 200 山氯仿，用力摇晃 15s,室温放置 5min。412000g 离心 15min,上清液转移至另一个 1.5ml 无 RNA 酶离心管中（已冰上预冷）。加入 500L 异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置 10min,沉淀 RNA。4C12000g 离心 10min,弃上清。加入 1ml75%乙醇（DEPC 水配制），用移液器反复吸打乙醇，洗涤 RNA 沉淀。4C7500g 离心 5min,弃去乙醇。9）用微型离心机将 EP 管内壁上的乙醇甩至管底，用 10L枪头吸出，打开盖子置于超净

4、台内晾十几秒，但不能让 RNA 全部干透，内壁上没有水珠即可。10）根据 RNA 的量加入无 Rnase 水 60-120 科 L,轻弹管壁，充分溶解 RNA,混匀后分装出少许用于测定RNA 浓度以及用于电泳检测。11）测定 OD260/OD280值以及 RNA 浓度。取 15RNA 用 DEPC 水稀释 100 倍，紫外分光光度计下读取RNA 浓度彳 1 和 OD260/OD280值（1.9-2.0 之间表示 RNA 纯度较好，小于 1.8 说明含蛋白质、杂质较多，大于 2.2 表示 RNA 降解）。建议：建议使用 200 山的枪头转移上清液，可减少蛋白污染。可用柱式 RNA 提取试剂盒，推

5、荐 TAKARA 公司的产品，提取速度快，无毒性，质量很好，价格比较高。Trizol推荐invitrogen公司的产品， 直接从公司订购要1200元/100mL,从科昊泽订只要750元/100mL,所以可以多咨询比对代购的价格。3 .反转录 cDNA多用转录试剂盒进行 cDNA 反转录，按照对应说明书操作即可。反转录过程需在超净台中进行。Invitrogen 和 TAKARA 的 cDNA 反转录试剂盒的质量很高。Invitrogen 的试剂盒步骤稍微繁琐，但最后得到的终产物量多。TAKARA 的转录速度快，但终产物量少。我 所 用 过 的 产 品 Invitrogen 的 货 号 是 C28

6、025-032 （ 50 次 反 应 ） ， TAKARA 的 是PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime,货号 DRR036A（200 次反应），和之后用的荧光定量试剂盒可以搭配使用。建议：cDNA 体系中 RNA 模板的浓度要一致，可用体系要求模板浓度和所测出的 RNA 浓度计算所需加模板量和无 RNA 酶水的量。推荐用 excel 计算，并打出表格，参照表格进行加样。4 .引物PCR 引物设计的目的是找到一对合适的核甘酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。引物的优劣直接关系到 PCR 产物的特异性及成功与否。根据试验选择引物。做 Real-time

7、PCR 的引物片段最好在 200bp 以下。可通过查找相关英文文献来选择引物，文献中会标注目的基因的引物、引物片段长度和在 NCBI 上的编号。如果引物查找不到，也可自行设计，在 NCBI 上查找所需基因，得到基因的碱基序列，用 DNAMAN 设计。确定了引物序列后，交由公司订购，获得引物后需要验证是否能用。建议：实验室所用引物主要在 invitrogen 公司设计，3 天左右能获得引物，也可以在金维智设计引物。国内公司生产速度较快，1 天左右就能完成。5 .RealtimePCR使用 TAKARA 的 SYBRPremisExTaqII（PerfectRealTime）试剂盒。试剂盒的实验原

8、理如下:SYBR.GreenI 是荧光定量 PCR 最常用的 DNA 结合染料，能与双链 DNA 非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的 SYBR?GreenI 荧光强度，达到检测 PCR产物扩增量的目的。PCR 反应生成双链 DNA,SYBR?GreenI 与双链 DNA 结合后会发出荧光， 通过检测荧光信号的强弱，不但可以检测反应体系中的 DNA 的扩增量，同时还能测定扩增产物的 DNA 熔解温度。具体原理见下图：3.延伸反应延伸反应嵌合荧光染料法原理图根据说明书中不同的荧光定量仪器对应反应体系配制不同的反应液。耗材多用 96 孔板（半裙边）和 8 联管（8 联 TUBE）

9、。加样方式推荐先用无菌离心管混好除样品外的所有试剂，颠倒混匀，短暂离心，再分装到每个 PCR 管中，取第一管时用枪头吹打数次。分装好后，再向管中加入样本。按照说明书要求设置程序后，开始进行 PCR 扩增。每个样品做 2-3 个重复，初上手建议做 3 个重复，数据处理时比较好剔值。扩增结果中 Ct 值标准差小于 0.5 时表示技术重复性好。5.ComparativeDelta-deltaCt 法ComparativeDelta-deltaCt 法即 AACCfe,是一种常用的相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别

10、进行 PCR 扩增即可。此方法的缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。所以在正式试验开始前，必须对目的基因和看家基因做标准曲线，如果两组标准曲线的斜率之差小于 0.1,那么后续实验中就可以用 AAC 怯进行相对定量分析。反之，如果斜率差值大于 0.1,就无法用该方法进行相对定量分析。只能优化反应条件或选择绝对定量方法进行分析。荧光定量仪器所带的软件可以给出两组标准曲线的 R2值、扩增效率、斜率等信息。如下图所示：热变性热变性2, ,引物退引物退火火Primerin对样品进行梯度稀释（1:5）,分别对目的基因（HIF-1）和看家

11、基因（actin）做标准曲线。二者斜率分别为-3.159 和-3.264,差值小于 0.1,所以可以用 AAC 怯对两种基因进行检测。进行正式试验，对看家基因和目的基因进行扩增，得到一系列 Ct 值。导出数据前，可以先在软件中进行数据处理。 调整所有结果中同种基因阈值 （Threshold） 相同。 根据熔解曲线 （MeltCurve）剔除熔解曲线异常的数据。导出数据后，根据相对定量公式（2-AACt 计算每个样品基因的相对表达量。样品目的基因 CtMean看家基因CtMeanCtCt八ACt2对照组X1X2X1-X2实验组Y1Y2Y1-Y2(Y1-Y2)-(X1-X2)2-(Y1-Y2)-(

12、X1-X2)Ct=CtMean目的基因-CtMean看家基因；Ct=ACt实验组-Ct对照组；实验组和对照组的基因表达差异为2-AACt数据统计方法根据试验设计进行选择。111actinactinactinSTANDARDSTANDARDSTANDARDSYBR4-loneSYBR-NoneSYBR-None207142033020.7875actinSTANDARDSYBR,one22,5635actinSTANDARDSYBR-None22,6495actinSTANDARDSYBR-Non&22.73325actinSTANDARDSYBR-None24,79125actinSTANDA

13、RDSYBR-Tlone24.92725actinSTANDARDSYBRone24,848125actinSTANDARDSYBRAIone27,497I25actinSTANDAFCSYER-Mone27.517125actinSTANDARDSYER-None27.625StandardCurve口一叫7?1hrf-1STANDARDSYBR.-CJone25.9441hif-1STANDARDSYBR-None25.6701hif-1STANDARDSYBR-Nane25,8445hif-1STAPIDFC SYBR-NOHT27,9535hif-1STANDARDSYBR-Non-?27.9405hif-1STANDARDSYBR-Ilone20.