qPCR引物设计

1、荧光实时定量 PCR 引物设计I.靶的选择和试验设计1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的 QRT-PCR 的扩增引物，探针以及反应条件.RTPrimerDB(http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb),相对物种较多PrimerBank(/primerbank/index.html)人，鼠RealTimePCRPrimerSets()人，mouse,rat 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计方案仅供参考：A.

2、最广泛使用的商业化的软件 BeaconDesigner(http:/)B.DIY 的软件 PrimerExpressC.如果 BeaconDesigner 无法得到您说需要的结果，或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择 Sigma-Genosyshttp:/)的服务方案，详细周至 UD.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序：http:/ 4-6 对引物进行试验，选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与 NCBI 的网站进行比对，并且用 NCBI 的 ePCR 进行虚拟的电子 PCR引物设计简介DNA 引物长度：15-25 个碱基GC 含量:50%左右如果引物的与 AT

3、区域富集结合，可以考虑用 LNA 替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和 3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的 4G 为负值，即:引物二聚体及发夹结构(duplexformationandhairpin)、 错误引发位点(falseprimingsite)、 引物及产物 GC 含量(composition),有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用 Oligo 软件分析设计引物为例，有以下一些要点：1 .引物的长度一般为 15-30bp,常用的是

4、 18-27bp,但不能大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于 74C,即 Taq 酶的最适温度。2 .引物 3 端的序歹 U 要比 5 端重要。引物 3 端的碱基一般不用 A(3 端碱基序列最好是 G、C、CG、GC),因为 A 在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间 3端的互补、二聚体或发夹结木也可能导致 PCR反应失败。5端序列对 PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3 .引物的 GC 含量一般为 40-60%,以 45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的 GC 含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的

5、GC 含量以及Tm 值保持接近(上下游引物的 GC 含量不能相差太大)，以有利于退火温度的选择。如果 G-C 比例超出，则在引物的 5端增加 As 或 Ts；而如果 A-T 比例过高，则同在 5端增加 Gs 或 Cs。但也有认为：原来普遍认为 PCR引物应当有 50%的 GC/AT 比率的观点其实是不对的，以人基因组 DNA 为模板，用 81%AT 的引物可以产生单一的、专一的、长 250bp,含有 70%AT 的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR 引物的 GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的模板的 GC/AT 比。4 .引物所对应模板序列的 Tm 值最女?在 72

6、c 左右。(Tm 值曲线以选取 72 度附近为佳，5 到 3的下降形状也有利于引物引发聚合反应)，至少要在 5580C 之间5 .值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的 4G 值最好呈正弦曲线形状，即5 端和中间 4G 值较高，而 3 端 4G 值相对较低，且不要超过 9(4G 值为负值，这里取绝对值)，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3末端双链的 4G 是 02kcal/mol 时，PCR 产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6 时只有 40%、到8 时少于 20%、而10 时接近于 0。6 .可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序

7、列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过 100,如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 450 以上，而在错误位点的引发效率为 130,并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。7 .Frq 曲线为 Oligo6 新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 Frq 值相对较低的片断。8 .引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一

8、个参数是碱基的分布，3端的连续 GGG 或 CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其 4G 为一 3kcal/mol 的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的 3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在 5末端对反应就没有多大的影响了。9 .以公式（4G/C+2A/T 七）计算 Tm 值，即退火温度。选择较低 Tm 值的引物的退火温度为反应的退火温度。4-6C的差别似乎对 PCR 产量影响不大。最好，保证每个引物的 Tm 值相匹配，且在

9、70-75C 范围内10 .要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR 的效率越高。因为 DNA 的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500bp,选用短的（1618mer）的引物：若产物长 5kb,则用 24mer 的引物。有人用 2023mer 引物得到 40kb 的产物。11 .在 DNA 测序和 PCR 中最好用 5末端稳定（如 GC 含量较多），而 3末端不太稳定（如 AT 含量较多）的弓 I 物，这种引物的结

10、构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其 3末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在 3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发 DNA 合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的 5末端和中央部分必须与靶 DNA 也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC 丰富的 3末端的寡核昔酸不需要其所有的核音酸序列都与靶序列配对，只凭借其 3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。无论如何，寡核昔酸 3末端最后 5 个核昔酸的稳定性小于9kcal/mol 的，通常就是专一性的探针或引物。寡核昔酸 3末端

11、越不稳定，假引发的可能性越低。12 .如果用 3末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。13 .引物的唯一性：为了放大单个的、专一性 DNA 片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用 Alu 序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物（如一 AAAAAA）和二核昔酸重复（如一 ATATAT-）。14 .引物和产物的 Tm 值不要相差太大，20 摄氏度范围内较好。定下引物的 Tm 值范围之后即可定下引物的长度范围。15 .对引物的

12、修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。16 .值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时 PCR 产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此 PCR 引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。17 .在设计克隆 PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种 PCR 需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。18 .如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）要提醒的一点是如果用发夹形的寡聚核昔酸探