HPV疫苗的制备-马小艮

1、HPV 疫苗的制备及作用效果HPV 是一类能够感染皮肤和粘膜的 DNA 病毒。高危型 HPV 是宫颈癌以及癌前病变的要致病因子，99.7%的宫颈癌组织都检测出高危型 HPV。针对 HPV 感染，人类自身所产生的免疫应答主要分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要表现为 HPV 刺激机体 B 细胞产生抗 HPVL1、L2 蛋白的抗体，但是由于产生抗体的量特别少，所以很难检测到这些特异性抗体，阻碍了人们对体液免疫的相关研究。细胞免疫主要表现为 T 细胞受 HPV 刺激后通过释放淋巴因子来杀死感染病毒的细胞1,2。目前预防和治疗 HPV 相关癌症最有效的方法是研制其特异性的 HPV 疫苗，诱导机体产生中

2、和抗体，激发保护性免疫反应，以达到预防 HPV 相关癌症发生和传播的目的，既可以降低宫颈癌的发病率，也可降低与 HPV 感染有关的其它癌症的发病率。人类乳头瘤病毒（HPV 是一种无包膜的双链闭环小分子 DNA 病毒，属乳头多瘤空病毒科乳头瘤病毒属。其基因约 8kb,只有 1 条 DNA 链可作为转录模板，含 8 个开放阅读框（openreadingframes,ORFS,分 3 个基因区，即早期区（earlyregion,E 区）、晚期区（lateregion,L 区）与非编码区（uncodingregion,UCR 或上游调控区（URR。E 区编码 E1,E2,E4,E5,E6,E7 等早期

3、蛋白，参与病毒 DNA 的复制、 转录、 翻译调控和转化等功能； L 区编码主要衣壳蛋白 L1 和次要衣壳蛋白 L2;UCR区含有 HPV 基因组复制起点和 HPV 表达所必需的调控元件。由 HPV 产生的两种癌蛋白是 E6 和 E7,可以抑制细胞周期负调节因子的活性，并可以在肿瘤细胞中高度表达。而晚期基因则编码衣壳的结构蛋白，其中主要衣壳蛋白 L1 结构保守，是 HPV 衣壳的主要成分，约占衣壳蛋白的 80%以上，因此成为理想的预防免疫靶位。基于 HPVW 致病机制和天然的免疫原性，HPVS 苗研究聚焦于 L1、E2、E5E6 和 E7。目前 HPVW 疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预

4、防性疫苗主要诱导机体体液免疫反应，产生的中和性抗体在 HPV 进入机体前即能与病毒的抗原结合，从而防止 HPV 的感染。治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性 T 细胞能识别和攻击 HPV 感染的细胞，其中也包括 HPV 引起的恶性肿瘤细胞。（一）HPV 预防性疫苗1 .预防性疫苗的制备依据及过程预防性疫苗一般以 HPV 主要衣壳蛋白 L1 和次要衣壳蛋白 L2 为靶抗原3,其作用在于诱发肌体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应，以阻止 HPV 的长期感染和再感染。HPV 的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒（virus-likepartic

5、les,VLPs）,其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，将其置入机体后可刺激产生中和抗体 IgG 和 IgA4,达到预防相应型别 HPV 的感染，而且不包括病毒DNA,安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可能性5,6。VLPs颗粒直径为 50-55nm,分子量为 55-60kDa,VLPs是由纯化的 L1蛋白装配形成 HPV的空衣壳。 VLPs的最小结构单元是 L1 蛋白单体，L1 蛋白主要是由 8 条反向平行的 3 折叠肽链段构成的，它们之间是由无规则的环形区（loop）连接在一起的，每个环形区大约有 1030 个氨基酸（aa）,这些区域绝大部分延伸到

6、五聚体和病毒颗粒的外表面，是抗原表位的所在区域7-9;不同型别 HPV 环形区的序列和空间结构是不同的，所以 HPV具有高度的型别特异性。因此，目前对于 HPV 抗原表位的研究主要集中在 L1 蛋白的环形区上10。国内外有多家机构在进行 HPV 疫苗的研究及其制备，大部分都是以 L1 和（或）L2蛋白为靶标进行制备的（单独表达 L1 或者联合表达 L1+L2,获得病毒样颗粒（VLP）。一般步骤都是针对 HPVL1 和（或）L2 蛋白的核酸序列为基础，对其进行改造优化（例如密码子优化，删除部分序列，替换某个/些碱基，连接其他基因等），扩增或者合成优化后的序列，然后将其克隆到表达载体上，并在原核系

7、统（例如大肠杆菌）或者真核系统（例如昆虫细胞，酵母，哺乳动物细胞等）进行表达，再将表达的单个蛋白或者融合蛋白分离纯化，添加佐剂后制成疫苗，通过将制成的疫苗免疫小鼠或者其他动物对其免疫原性进行评价，效果较好的进行临床实验。2 .已经被批准上市的预防性疫苗目前已经被批准上市的预防性 HPV 疫苗有两种，它们分别是英国葛兰素（GlaxoSmithKline,GSK）公司的双价疫苗“Cervarix”和美国默克（Merck&Co.,Inc.）公司生产的四价疫苗“Gardasil”（商品名）11。随着这两种疫苗的上市，人们对宫颈癌疫苗的研究主要集中在 HPVVLPs 疫苗上。2006 年，“Ga

8、rdasil”被批准上市，这是第一个商品化的宫颈癌预防性疫苗，它是由两个高危型 HPV16、18 和两个低危型 HPV6、11 的L1-VLPS 组成的重组混合型疫苗，它们使用酿酒酵母体系产生 VLPs，佐剂为氢氧化铝（225ug） 。 2007 年， 英国葛兰素公司的“Cervarix” （商品名） 疫苗上市 12,它是 HPV16、 18 的 L1-VLPs组成的重组混合型疫苗，利用重组杆状病毒感染的昆虫细胞（粉纹夜蛾）产生 VLPs,佐剂为传统铝盐（500ug）加上 AS04（50ug）13,14。这两种疫苗都是预防性的，不是治疗性的，主要接种于未发生 HPV 感染的人群，用来预防 HP

9、V 感染以及相关疾病的发生。这两种疫苗的抗原都是 HPV 主要衣壳蛋白的 L1。临床试验结果证明，上述疫苗均具有良好的耐受性， 且没有严重的不良反应， 抗体效价比自然感染 HPV 的患者高 50 倍。 此外， 最近 Merck公司又研发出了 Gardasil 九价预防性疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）。Gardasil 已在 117 个国家或地区被批准使用，全球 33 个国家多中心的联合试验结果表明，疫苗对宫颈癌、癌前病变以及其他生殖道疾病的预防作用可达 99%100%;Cervarix 疫苗对 HPV16 和 HPV18 所致 CINn、 出的保护效力达到 1

10、00%;Merck 公司的九价疫苗已经于 2015 年进入三期临床试验。二价疫苗针对 HPV1618 产生的保护性抗体均可维持 100%的血清阳性至少 8.4 年15;四价疫苗针对 HPV16 产生的保护性抗体能维持 98.8%的血清阳性至少 5年16。3 .其他处于研究阶段的预防性疫苗（部分）Xie 等17在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了 HPV16,18,58LIVLPs,对各型 VLPs 进行了纯度、形态学及免疫原性的研究，特别是 HPV58L1VLPs 诱发长期中和抗体活性及协同 A1（0H）3佐剂的相关研究。在此基础上，表达及纯化了以 HPV16L1VLPs 为载体的嵌合各种 HPV1

11、6L2 保守表位的杂合蛋白，并对影响杂合 L1 组装能力及其诱发中和抗体活性的因素进行了研究。HPVLIVLPs 免疫小鼠测定 ED50,将 HPV16,18,58LIVLPs 单独或混合免疫小鼠诱发了较高滴度的针对组成型别的中和抗体，表明 HPV16,18,58LIVLPs 免疫原性很强。韩国的金洪珍等 18 通过优化16型和18型的HPV序列， 构建至pUCminvsMCS载体及YEG-MCS酵母表达载体，以酿酒酵母为宿主菌进行表达，通过肝素层析和阳离子交换层析进行表达蛋白的纯化并进行浓缩。纯化得到的蛋白添加佐剂后免疫小鼠，发现组合佐剂增加了免疫刺激效果，总 IgG 效价增高。该药物疫苗组

12、合物可比常规疫苗（包才 CervarixTM及 GardasilTM）诱导更强的针对 HPV 的免疫应答，因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外，该药物疫苗组合物由于用作免疫彳剂的脱酰基化的非毒性 LOS 几乎无细胞毒性而具有优良安全性。该药物疫苗组合物比施用 CervarixTM 及 GardasilTM 显著提高与 Th1 型免疫应答（细胞免疫）相关的干扰素-丫、 IgG2a 及 IgG2b 水平， 以及与 Th2 型免疫应答（体液免疫）相关的 IgG1水平。总体来说，本药物疫苗组合物可诱导均优于 CervarixTM 及 GardasilTM的针对 HPV 的 Th1 型免疫应答（细胞免疫）

13、及 Th2 型免疫应答（体液免疫）。厦门大学的李少伟等19对全长 HPV31L1 基因依照大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化（片段全长为 1515bp，终止密码子为 TAA）,由上海博亚公司合成该基因，酶切后与非融合表达载体 pTO-T7 连接，转入 ER2566 大肠杆菌，用 50L 的发酵罐进行大规模培养，用 IPTG进行诱导表达，之后分离纯化（HPV31Ctag-L1 的阳离子交换色谱）L1 蛋白，对得到的蛋白通过 Western 和质谱进行鉴定，用 CENTRASETTE5 切向流系统对 L1 蛋白进行组装，对 HPV31L1病毒样颗粒进行透射电镜观察和动态光散射检测。 将制得的该病毒样颗粒

14、稀释至 0.1mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂等体积的不完全弗氏佐剂，免疫小鼠/兔子后进行免疫保护性的评价。发现通过该方法获得的 HPV31-L1 病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防 HPV31 感染的疫苗。马润林等20克隆了 HPV16L1 衣壳蛋白基因，进行修饰（碱基替代）后在大肠杆菌中表达（表达质粒为 pGEX-6-1,表达菌株为 BL21）,分离，经亲和色谱纯化重组 HPV16L1 蛋白五聚体（该五聚体与 HPV16L1 蛋白的 VLP 具有相同的免疫原性和抗原性），将所得重组 HPV16L1蛋白五聚体与辅料（佐剂包括吕盐/3-O-去

15、酰化单磷酸类脂/脂质 A 衍生物，赋型剂包括生理水以及其它药物上可接受的赋型剂，稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液）混合制剂，得到 16 型重组人乳头瘤病毒疫苗。具体步骤为将纯化的 HPV16L1 的五聚体与 100mMNaCl 的标准磷酸缓冲液混合（pH7.2）,加入 150ug 氢氧化铝，调整五聚体浓度至 10ug/支，制成疫苗。动物安全性实验发现重组 HPV16 疫苗对供试动物未发现任何可观测到的急性毒性和异常毒性，全部毒性检测指标为阴性。动物有效性试验发现组 HPV16 疫苗能诱导供试动物产生强烈的抗体保护反应，抗体有效中浓度 ED0 在 0.4-2.0 微克，抗原的免疫原性及抗体的滴度

16、水平很高。（二）HPV 治疗性疫苗在感染 HPV 所引起的的恶性肿瘤细胞中，病毒 DNA 整合到宿主细胞 DNA 中，结果导致 E6、E7 基因异常过量表达而使细胞无限增殖，并最终向恶性转化；同时，晚期蛋白 L1、L2 基因会断裂丢失，使其不能表达或仅有部分蛋白被低水平表达而难以检测到，因此预防性疫苗对已经感染 HPV 并引起癌前病变的的患者没有保护能力，不能使他们被治愈。研究表明，HPV 感染引发的癌前病变以及癌症的发生主要是由 HPVE6、E7 的协同作用所致，因此针对 E6、E7 为靶抗原的 HPV 治疗性疫苗成为研究的重点21,22,23,24。1 .治疗性疫苗的制备主要依据由于 HP

17、VE6/E7 蛋白具有致癌性，将这两种蛋白直接应用于治疗宫颈癌时会存在疫苗的安全隐患，通常对关键位点进行突变以降低致癌性。通过对 HPVE6 蛋白和 E7 蛋白结构功能和突变体的深入研究，可以有靶向性地对 E6 和 E7 基因进行突变和改造，消除 E6 蛋白和 E7蛋白的致癌能力和转化活性，从而降低了将 HPVE6/E7 蛋白应用于治疗性疫苗开发的风险，保证安全性。对 HPVE6/E7 基因进行突变，使其失去致癌性，同时保留免疫原性是研制宫颈癌治疗性疫苗的主要手段之一25。2 .治疗性疫苗的种类及制备HPV 治疗性疫苗的类型主要有：多肽/蛋白质疫苗26、活病毒载体疫苗、DNA 疫苗、RNA 疫

18、苗27。目前尚无有效的 HPV 治疗性疫苗问世。但重组蛋白疫苗、多肽疫苗已进入二期临床试验，并显示出良好的前景。蛋白疫苗：多肽/蛋白疫苗是采用肿瘤特异性的多肽片段或抗原蛋白作为疫苗直接免疫机体，诱导机体产生抗原特异性的 CTL 反应来杀伤肿瘤细胞。Chen 等首先证实，HPV16E7免疫动物可获得特异性 CD8 阳性淋巴细胞介导的肿瘤排斥反应。BermudezHumaran 等28通过乳酸乳球菌生产 HPV16E7 蛋白。多肽疫苗：多肽疫苗的作用原理与蛋白疫苗类似。Liu 等构建了一种新型的疫苗 E7 蛋白 CTL 表位 4462 和热休克蛋白（Hsp70）的融合多肽疫苗29,使用 rAAV

19、作为载体，动物实验中显示出良好的肿瘤保护作用，转染效率高，且使用 rAAV 可使作用延至 l5 年，避免反复使用及由此产生的中和抗体。活载体疫苗：活载体疫苗是将肿瘤特异性抗原蛋白的基因插入活载体(细菌或病毒等)，高效表达抗原从而刺激抗原特异性的免疫反应。活载体疫苗免疫原性高，作为抗原载体的免疫刺激效果好。但是，活载体可能有潜在的安全风险，尤其是对于免疫功能不全的患者。常用疫苗的载体主要有病毒(牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒和 a 病毒等)，细菌等。Li 等30采用天坛牛痘株构建了表达 HPV16 和 18E6/E7 蛋白的重组牛痘病毒疫苗 rVVJ16/18E7E6,在对小鼠和恒河猴的研究中，该

20、疫苗均显示细胞免疫反应，而且对小鼠的肿瘤移植保护实验也显示出一定的效果。田厚等31,将 HPV16 型早期蛋白 E7、E6 编码区基因融合，并将E7、E6 编码区基因进行改造修饰去除其转化活性，保留抗原性，再根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计其相应的优势密码子核酸序列交给公司合成。将合成的经密码子优化过的 E7E6 融合基因插入到腺病毒重组载体质粒 pCD316 中，与 Ad5 病毒载体骨架质粒共转染 293细胞，经纯化并进行 E7E6 融合基因及蛋白的鉴定，筛选出表达人乳头瘤病毒 HPV16 型 E7E6融合蛋白的重组腺病毒 rAd5HPV16SmE7E6 扩增重组病毒， 经动物免疫实验评价， 表明所制备出的重组腺病毒 rAd5HPV16SmE7E6M 有免疫活性，其能够诱发免疫动物产生针对 HPV16E7的特异性 T 细胞介导的细胞免疫应答，对肿瘤的生长有明显抑制作用。DNA 疫苗：Smahel 等使用修饰了的 HPV16E7 基因 DNA 疫苗进行体外实验32,在 E7 基因 Rb 结合点加入 3 个突变位点 GGG 实验对比 4 种疫苗的作用：E7、ETGGGM2 种融合基因 L16cE、Sig/EAMPI。结果显