酶工程实验20153

1、实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定一、 目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。二、 实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/1/S作图求Km三、 实验器材1. 锥形瓶100150ml（×6）。2. 吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。3. 温度计（0100）。4. 微量滴定管5ml（×1）。5. 容量瓶1000ml（

2、×1）。四、 实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确

3、浓度稀释成0.004mol/L即可。5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一 过氧化氢酶米氏常数的测定 管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml09.50.51.008.500.51.258.250.51.677.

4、830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。六、计算分别求出各瓶的底物浓度S和反应速度v。S=c1V1/10 式中S：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；：反应速度（m mol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO

5、4体积（ml）；以1/对1/S作图求出Km。实验二 酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而

6、底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1mol产物所需的酶量。要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率

7、变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.60.7之间。（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。（4）0.3mol/LNaOH溶液2器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在2530°C温箱中培养57d。长出

8、的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热

9、2min。然后向111号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。3.数据处理以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

10、表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量试管号12345678910110NPP（mL）稀释酶液(mL)反应时间（min）03M NaOH(mL)1.01.033.01.01.053.01.01.073.01.01.0103.01.01.0123.01.01.0153.01.01.0203.01.01.0253.01.01.0303.01.01.0403.01.01.0503.01.01.0253.0五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、 目的：了解酶的纯化方法。二、 原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(E

11、C.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。（请参考相关教材）三、 试剂与仪器1、试剂与材料：(1) 干酵母(2) 石英砂(3) 1 mol/L醋酸溶液(4) 2 mol/L氢氧化钠溶液(5) 醋酸缓冲液（pH 4.6）(6) 5% 蔗糖溶液(7) DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。四、 操作方法1、 破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20）冰冻约20min（研磨液面上刚出现冰结为宜

12、）。取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V1，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶。2、 纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。然后迅速放入到55 的水浴中，保温30 min。之后在冰浴中迅速冷却。在5000 r/min条件下离心12 min。取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5 ml上清液到试管C、D中。3、 酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管编号酶液氢氧化钠溶液醋酸缓冲液蔗糖溶液A（对照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlB0.5 ml-

13、2 ml1 mlC（对照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlD0.5 ml-2 ml1 ml试管中反应物在55 水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。4、酶催化产物检测 取5支试管，分别加入反应物：试管编号反应液DNS试剂10.5 ml A0.5 ml20.5 ml B0.5 ml30.5 ml C0.5 ml40.5 ml D0.5 ml5（空白）0.5 ml 蒸馏水0.5 ml试管中反应物在沸水浴中反应5 min，然后冷却。加入4 ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定

14、它们的吸光度值A540。五、 结果计算1、 酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55条件下，每1 min催化底物转化为1 mg还原糖的酶量。2、 酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：纯化后酶的计算酶活（组分二）：3、 总酶活的计算：总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数4、 酶活回收率的计算：酶活回收率 = 附：还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还

15、原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。实验四 蔗糖酶包埋及固定化酶活测定一、 目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。二、 原理：海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从

16、而把酶包埋在其中。（请参考相关教材）三、 试剂与仪器1、试剂与材料：(8) 干酵母(9) 海藻酸钠(10) 无水氯化钙(11) 5% 蔗糖溶液(12) DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。四、 操作方法4、 配A液取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。自然冷却。5、 配B液取1 g干酵母溶在25 ml蒸馏水中（室温），搅匀。6、 配C液A液冷却后，将B液倒入其中，搅匀。4、配CaCl2液取2.2 g无水CaCl2溶于200 ml蒸馏水中。5、

17、制备胶珠用注射器（7号针头）将C液滴入CaCl2溶液，滴时不断搅拌溶液。静置20 min，固化胶珠。纱布过滤得到胶珠，用蒸馏水清洗胶珠，称取湿胶珠质量（W1），并记录。6、催化取1 g湿胶珠置于烧杯中，加入20 ml 5%蔗糖溶液，37反应10 min，取出反应液，与胶珠分离，反应终止。7、酶催化产物检测将反应液定容至20 ml，取0.5 ml稀释至5 ml，得D液。取2支试管，分别加入反应物：试管编号反应液DNS试剂10.5 ml D0.5 ml2（空白）0.5 ml 蒸馏水0.5 ml试管中反应物在沸水浴中反应5 min，然后冷却。加入4 ml蒸馏水。将各试管摇匀，用空白管溶液调零点，测定

18、它们的吸光度值A540。五、 结果计算5、 酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在37条件下，每1 min催化得到1 mg还原糖所需酶量。6、 酶活计算：1 g固化酶酶活：六、 思考题1、海藻酸钙包埋法中钙起什么作用？与豆腐制作中Ca2+的作用有何关系？2、除了凝胶包埋法，还有哪些包埋方法？其原理是什么？实验五 尼龙固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共价交联法固定酶的原理和步骤二、原理尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。 三、实验材料、仪器和试剂1、材料尼龙布(86或66)，140目，剪成

19、3cm×3cm2、仪器(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱3、试剂(1)18.6%CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液(4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。(11)

20、0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。四、操作步骤1、固定化酶的制备(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋

21、白酶液，在室温下固定30min。(5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。2、酶活力测定A0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液B0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液取三支试管按上述加入反应液，37反应15min，A、C+2ml 10%三氯乙酸。三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）五、结果计算1.酶活定义：每15min增

22、加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。2.酶活回收=六、注意事项(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。(2)固定化酶溶液浓度最好为0.51mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。实验六、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明

23、圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。图 1 产淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、试剂和仪器1、菌的来源取不同地点的表层土壤。2、试剂：RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH无菌水和琼脂粉等。3、器皿 250mL三角瓶两个、 9.0cm培养皿若干、涂布棒、 200µL移液枪、 200µL枪头若干、牙签若干、指形管若干、 10mL具塞刻度试管四支、滴管四支、取样器和塑料直尺等。4、仪器设备高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。四

24、、实验操作步骤1、器皿的消毒：培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121下灭菌20 min，取出备用。2、培养基的配制与灭菌培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %,w/v）， NaNO3(0.2%,w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) ,MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KCl(0.1%,w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。在三角瓶中，121灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀， 影响菌落的观察。）3、土样的采集及稀释于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。4、富集称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。5、