藜麦皂甙提取及萌芽对皂甙含量的影响

1、基金项目：六盘水市级科技计划项目（52020-2015-02）收稿日期：2016-10-31作者简介：黄金，女，1991年出生，硕士，食品科学通讯作者：秦礼康，男，1965年出生，教授，食品科学藜麦皂甙提取及萌芽对皂甙含量的影响黄金 秦礼康 石庆楠 文安燕（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵阳 550025 ）摘要: 利用响应面分析法对藜麦籽粒皂甙的提取条件进行探索，并研究萌芽对藜麦皂甙含量的影响。在单因素试验的基础上，选取乙醇提取分数、料液比和浸提温度进行三因素三水平的Box- Behnken试验设计，通过响应面分析法对提取条件进行了优化；同时在优化条件下测定萌芽144 h藜麦中的皂甙含量变化。

2、结果表明，在560 nm波长下，最佳提取条件为乙醇体积分数65%，料液比140，浸提温度60 ，皂甙提取量为5.56 mg/g。萌芽试验结果表明，萌芽初期（6 h内）皂甙含量迅速下降，在642 h期间含量保持平稳，42 h后逐渐升高直至96 h时达最高值7.80 mg/g，萌芽120 h后皂甙含量开始下降。关键词：藜麦 萌芽 皂甙 响应面分析中图分类号：S512.9文献标识码：A文章编号：1003-0174（）Optimizing extraction process of quinoa saponins and investigating its variation during sprou

3、ting HuangJinQinLikangShiQingnanWen Anyan(School of liquor and food engineering，GuizhouUniversity，Guiyang 550025)Abstract:Response surface design was applied to optimize the extractionprocess of quinoa seed saponin.And then the effect of sprouting on saponin content was investigated. On the basis of

4、 single factor experiments, alcohol concentration, solid-liquid ratio and extraction temperature were selected for a three-factor-three-level Box-Behnken experimental design and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions. The desired amount of saponin was 5.56

5、 mg/g under the condition: 65% ethanol, solid-liquid ratio of 140 and extraction temperature at 60 . The germinating testresults showed that the saponin was quickly decreased in the early bud, kept steady during 6 42 hours and then increased gradually with sprouting after 42 hours. The peak value (7

6、.80 mg/g) was reached on the fourth day, after that, it declined slowly with germinating after 120 hours. Key words:quinoa, germinated,saponins,response surface design藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)，不仅富含蛋白质及钙、铁、锌和维生素E等微量营养素，而且含有全部必需氨基酸，具有提高人群健康，预防癌症、过敏、炎症以及降低心血管疾病12等多种疾病发生的潜在功效。古代印加人称其为“粮食之母”和“安第斯山的真金

7、”34。国际营养学家称其为“营养黄金”、“超级谷物”、 “未来食品”5。FAO 将藜麦评为“高营养价值的食物”6。联合国粮农组织(FAO)认为藜麦是唯一一种可满足人体基本营养需求的单体植物,并正式推荐藜麦为最适宜人类的全营养食品，将2013年设立为“国际藜麦年”7。藜麦具有丰富的营养价值，但藜麦中存在的抗营养因子皂甙，略有苦涩味且具有潜在毒性8，阻碍了藜麦在食用、加工和推广等方面的运用。藜麦皂甙主要以三萜皂甙的形式存在，含量在0.14%2.30%9之间，随着对皂甙的进一步了解，人们更加关注皂甙的生物活性及其对健康的作用。具已有研究表明，皂甙是一类具有抗炎10、抗过敏11、抗氧化12、抗糖尿病1

8、3、降胆固醇14等生物活性的物质，是许多中药的有效成分。藜麦皂甙的去除、提取及再利用一直是困扰研究者的难题。传统的流动水冲洗方法会造成大量的水资源浪费，同时也损失了皂甙的药用价值。种皮打磨30%15，浸泡水洗16亦可有效降低种皮皂甙含量。种子萌发是高等植物生命活动最强烈的一个时期，涉及到一系列形态和生理、生化的变化。通过发芽处理谷物可以改善它们的口感，提高营养成分的含量和利用率，以及降低抗营养成分的含量1718。澳大利亚学者在处理藜麦皂甙时发现，长时间的浸泡会导致藜麦发芽19。Ren S等20人发现苦荞种子萌芽处理期间总酚、总黄酮、芦丁含量逐渐增加，并在第9天到最大值。这些现象在开发芽类食品方

9、面受到了人们密切关注21。目前，藜麦商品粮皂甙含量标准及其检测方法尚不统一，提取工艺及条件各不相同。赵文婷22在乙醇浓度72%、提取温度71.5 、料液比120.8、提取时间147 min、吸收波长546 nm条件下测得藜麦麸皮的平均皂甙得率为1.685%。任卓伟等16在乙醇体积分数70%、料液比130、提取温度50 、吸收波长560 nm条件下测得藜麦的皂甙含量为10.709 mg/g。杜静婷等23在料液比391、乙醇体积分数74%、超声时间33 min、吸收波长550 nm条件下测得藜麦糠皂甙得率为23.371 mg/g。本研究在目前通用的藜麦皂甙提取方法的基础上，运用响应面法探索适宜的提

10、取条件，对萌芽144 h内的藜麦皂甙含量的变化进行动态监测，旨在为藜麦皂甙的综合利用提供理论依据。1材料和方法1.1 试剂与材料齐墩果酸标准品:Sigma;藜麦:甘肃省农业科学院。1.2 仪器与设备Spectra Max 190 酶标仪: Molecular Devices；MK-C315豆芽培育箱: MEIKONG；HYG-A全温摇瓶机:大仓市实验设备厂；FD-1A-50冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司；HC-700型超高速粉碎机:永康市天祺盛世工贸有限公司。1.3 方法1.3.1 标准溶液的制备参考任卓伟等16，赵文婷22的方法，选用齐墩果酸为标准品。准确称取齐墩果酸标准品50 mg

11、，加少量无水乙醇溶解后定容于50 mL的容量瓶中，制成1 mg/mL标准溶液。1.3.2 标准曲线的绘制16用移液枪准确地吸取 0、50、100、200、400 L的标准溶液，分别置于干燥的蒸发皿中，60 水浴蒸干取出；依次加入0.8 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液和3.2mL高氯酸，摇匀；用冰水浴冷却20 min，加入20 mL冰醋酸，摇匀，静置15 min。取400 L的标准品用酶标仪于500600 nm处进行扫描，选定最大吸收波长。以最大吸收波长处各浓度标准品的吸光度值(Abs)为横坐标，以相应齐墩果酸标准品浓度/mg/mL为纵坐标，绘制标准曲线。皂甙提取量根据标准曲线按下式计算: 皂甙提

12、取量/mg/g= CV/m其中，C为根据标准曲线求得的皂甙质量浓度/mg/mL；V表示提取液总体积/mL；m为藜麦总质量/g；1.3.3 响应面试验设计 单因素试验每次试验准确称取5 g过60目筛的粉碎藜麦粉（未萌芽），分别以乙醇体积分数、料液比、提取温度3个因素进行单因素试验，以皂甙含量为衡量指标。（具体方案见表1）表1藜麦皂甙提取单因素试验表因素水平乙醇体积分数/5060708090料液比/g:mL110120130140150提取温度/2030405060 提取工艺的优化根据单因素试验结果，结合Box-Behnken中心组合试验设计原理，确定了以乙醇体积分数、

13、料液比、提取温度三个因素为自变量，皂甙提取量为响应值，采用三因素三水平的响应面分析设计试验，对高氯酸比色法测定藜麦皂甙条件进行优化。（试验因素与水平设计见表2）表2 响应面分析因素与水平因素水平-101乙醇体积分数/607080料液比/g: mL120130140提取温度/405060 萌芽藜麦的制备粗藜麦（未脱壳）过筛，除杂后选取饱满完好的藜麦粒，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡20 min后用去离子水冲洗23次24。然后将藜麦米平铺于铺有四层纱布的培芽箱上，喷晒去离子水，放入恒温培芽箱于25 、间隔6 h淋水、间隔6 h臭氧杀菌条件下发芽。每隔6 h取样一次，分别制得发芽6、12、

14、18、24、30、36、42、48，60、72、96、120、144 h的发芽藜麦。然后将收集的发芽藜麦于冰箱预冻待收集齐全后冷冻干燥，粉碎，过100目筛，得到发芽藜麦粉。2 结果与分析2.1 齐墩果酸标准曲线由图1可知，齐墩果酸标准品在500600 nm处的最大吸收波长为560 nm，此结果与任卓伟等16的研究结果一致。因此，选用560 nm为检测波长。图1 齐墩果酸标准品不同波长的吸光度值图2 齐墩果酸标准曲线以吸光度值为横坐标（x），以齐墩果酸浓度/mg/mL为纵坐标（y）绘制标准曲线如图2，并采用线性拟合求得标准方程为y=2.863 1x+0.011 2；相关系数：R2 =0.997

15、4，显示在此范围内有良好的线性关系（图2）。2.2 单因素试验结果图3 单因素试验结果2.2.1 乙醇体积分数对提取藜麦总皂甙的影响大多数皂甙极性较大，多具有吸湿性，易溶于水、热甲醇和乙醇，难溶于丙酮和乙醚。结合实验室条件及安全性，故选择乙醇为溶剂。从图3可以看出，藜麦籽粒皂甙含量在一定范围内随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数为70%时，提取出的皂甙含量最大，为5.35 mg/g。之后随体积分数的增大含量反而减少，可能是因为当乙醇体积较大时，抑制了溶剂向物料的渗透，影响了皂甙的浸出，导致藜麦籽粒皂甙不能很好的提取出来13。因此选择70%的乙醇为藜麦籽粒总皂甙的最佳提取条件。2.2.2

16、 料液比对提取藜麦总皂甙的影响由图3可知，当料液比为130时，提取的皂甙含量最大，为5.14 mg/g。当料液比合适时，提取皂甙的效果才是最佳。太低时，提取不充分；太高，虽能完全提取，但提取液浪费较多。因此，由单因素实验结果显示，藜麦皂甙提取的最佳料液比为130。2.2.3 提取温度对提取藜麦总皂甙的影响从图3可以看出，温度从20 升高到50 ，提取出的皂甙含量先缓慢降低再匀速升高。5060 时的皂甙提取含量相差不大。可能是因为湿度升高加速了溶质的扩散及溶剂的渗透，从而使得提取含量的升高；而温度过高时也加快了杂质的溶出，从而与黎麦皂甙的溶出产生了竞争，影响了皂甙的溶出效果22。基于实验室条件限

17、制及实验安全性，故选用50 为最佳提取温度。2.3 响应面试验设计及结果2.3.1 响应面提取藜麦皂甙模型及显著性检验应用Box-Behnken模型的中心组合试验设计原理，根据单因素实验结果进行三因素三水平的试验设计，其中自变量为乙醇体积分数：70%；料液比：130；提取温度：50 ，以总皂甙含量为响应值，进行响应面分析，试验设计及结果见表3。表3 响应面试验设计及结果序号A:乙醇浓度%B:料液比gmLC:提取温度皂甙含量mg/g10005.192-1-104.2831-104.3340005.2850005.356-1015.371014.288-1105.190-114.55100115.

18、321101-14.8121104.64130005.2614-10-14.11510-14.55160-1-14.25170005.32在上述17个试验中，有12组析因试验，12个析因点为自变量在A、B、C所构成的三维定点。以及5组中心零点试验，用于估计试验误差。对表中的试验结果进行多次拟合回归分析，得到模型的二次多项回归方程为：Y=5.28-0.12A+0.31B+0.22C-0.13AB-0.37AC+0.055BC-0.43A2-0.26B2-0.29C2其中对该模型进行方差分析，结果见表4表4 响应面试验结果的方差分析 变异来源平方和自由度均方F 值P值显著性模型3.4590.381

19、10.85< 0.0001 A-乙醇体积0.1210.1234.690.0006 B-料液比0.7510.75216.81< 0.0001 C-温度0.3810.38110.62< 0.0001 AB0.0710.0718.790.0034 AC0.5410.54156.1< 0.0001 BC0.0110.013.50.1037 A20.7910.79227.58< 0.0001 B20.2810.2882.25< 0.0001 C20.3510.35102.32< 0.0001残差0.0273.46E-03失拟项0.0133.08E-030.820

20、.5467纯误差0.0243.75E-03总和3.4816R20.993 调整R20.9841由方差分析表4可看出，本试验选用模型 P<0.0001，表明模型达到极显著；失拟项P0.5467 >0.05，表明失拟不显著；相关系数R2=0.993；信噪比26.957，远大于4，这说明该回归方程的拟合度和可信度均很高。因此，此模型可用于预测高氯酸法测藜麦皂甙及工艺优化。由方差分析表中对回归方程系数显著检测可知，藜麦皂甙提取的乙醇体积分数、料液比、提取温度的一次项、二次项，乙醇体积和料液比、乙醇体积和温度的交互作用均达到极显著水平（P<0.01），料液比和提取温度的交互作用不显著。

21、由回归方程分析可知，影响藜麦皂甙提取的因素主次顺序为：料液比（B）>提取温度(C) >乙醇体积分数(A)。2.3.2 响应面分析及最佳条件确定响应面图形是响应值对各因素所构成的三维空间曲面图，在方差分析的基础上，利用Design Expert 绘制交互项乙醇体积分数，料液比，提取温度交互作用的曲面图和等高线图，如图4，图5，图6所示：图4 Y=f(A,B)响应面与等高线图图5 Y=f(A,C)响应面与等高线图图6 Y=f(B,C)响应面与等高线图由于等高线的形状可以反映交互项的强弱，等高线图呈椭圆形表示两者交互作用显著，圆形则与之相反。由图6的响应面等高线图可以看出，图6呈现出的形

22、状没有其它图的明显。结合方差分析表的数据，因素间的交互作用对提取率的影响效果为：AC>AB >BC表5 萌芽藜麦皂甙含量萌芽时间h皂甙含量mg/g百分含量05.560.5663.600.36123.500.35183.600.36243.410.34303.370.34363.410.34423.120.31483.410.34604.460.45726.750.68967.800.781207.800.781447.130.71通过Design Expert软件对非线性回归模型进行求解，得出最优的因素水平分别为：乙醇体积分数63.74%，料液比138.33 g/mL，提取温度58

23、.52 ，在此条件下皂甙含量预测值为5.54 mg/g。由于操作可行性，将最佳条件修正为：乙醇体积分数65%，料液比140 g/mL，提取温度60 。在此条件下进行三次平行验证试验，测得藜麦皂甙含量均值为5.56 mg/g，结果与预测值相近。2.4 萌芽藜麦皂甙含量测定经过单因素试验及响应面优化试验，得到修正的藜麦皂甙最佳制备条件为：乙醇体积分数65%，料液比140 g/mL，提取温度60 。在此条件下测得萌芽藜麦皂甙含量，结果如表5：图7 萌芽藜麦皂甙含量从图7可看出，萌芽6 h内的藜麦皂甙含量极速下降。藜麦籽粒皂甙80%集中于种皮7，且藜麦属于易发芽的种子25。在萌芽初期，种皮吸水膨胀掉落

24、，皂甙随淋水而流走，从而导致皂甙含量的骤降。之后在642 h之间，皂甙含量变化不大，保持3.5 mg/g上下小幅度浮动。从42 h开始，皂甙含量逐渐升高，4872 h期间萌芽藜麦皂甙含量增长速度高于7296 h。王莘等26对萌芽期绿豆功能性营养成分的研究发现，萌芽39 h后，异黄酮和皂甙含量出现最大值，分别增加54.8%和138%。萌芽96 h后，藜麦皂甙含量出现缓慢下降趋势。萌芽后期，皂甙含量增加的原因及机理，目前还没有相关报道。据PawelPasko等27对萌芽藜麦抗氧化性的研究表明，萌芽藜麦抗氧化活性的明显增高是因为萌芽过程使多酚、花青素及其他未知成分含量的增加。L.Alvarea-J等

25、28认为萌芽过程中某些内源性水解酶的产生及其活性的增加导致萌芽期间抗氧化活性增加。3 结论本试验采用响应面法对藜麦籽粒中皂苷的提取条件进行探索，得出最佳调提取条件为: 乙醇体积分数65%，料液比140 g/mL，提取温度60 。影响藜麦皂甙提取的因素主次顺序为：料液比（B）>提取温度(C) >乙醇体积分数(A)。在此条件下，观察萌芽144 h的藜麦皂甙含量的变化，发现萌芽初期（6 h内）皂甙含量较未萌芽状态下降了约40%，642 h保持约3.5 mg/g，42 h后开始增加直至96 h时达最高值0.78 mg/g。萌芽后期（120 h后）皂甙含量缓慢减少。至于皂甙含量增加的原因及机

26、理、萌芽藜麦抗氧化活性的增高是否与皂甙含量的增加有关待进一步的研究。参考文献1Dini I,Tenore G C, Dini A. Antioxidantcompound contents and antioxidant activities before and after cooking in sweet and bitter Chenopodium quinoa seedsJ. Food Science and Technology,2010,43:4474512Han X,Shen T,Lou H. Dietary polyphenols and their biological si

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