细胞培养 中和试验、TCID50原理 方法

1、实验二 传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145：来源于Vero细胞TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞 三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞3、0.25%胰酶4、生长液：含10%犊牛血清、200U/m

2、l青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM5、伪狂犬病病毒液（PRV）四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3×105个/ml2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度 哺乳动物细胞一般为37 昆虫细胞28-30五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。3、灰色链丝菌酶 ：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽

3、酶的混合物。六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。2、血清1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56灭活30min。3）血清的作用A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。E、给培养液提供良好的缓冲系统。F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶

4、的损害。4）应用血清存在的问题A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。七、传代细胞系培养1、优点：1) 可以无限的传代。2) 不少细胞系对病毒很敏感。3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。3、培养方法1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。2）加入2ml 胰酶消化液，于37培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。3

5、）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。2、加入适量的病毒悬液3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。5、收毒：将病变的细胞置于-20冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）一、实验目的 了

6、解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。二、材料1、9-11日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小镊子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml传代细胞：2-3×105个/ml2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37 昆虫细胞28-30四、操作步骤1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡

7、胚放于灭菌平皿中。3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。8、静置几

8、分钟，使未消化好的组织块下沉。9、细胞计数 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。 活细胞数应在90%以上。10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37恒温箱中培养。表示可计数表示不计数五、结果的观察 于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时

9、，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。实验四 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）一、实验目的 了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料 1、长满单层的细胞1瓶

10、2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到23×105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TC

11、ID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累 计出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6 （11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathic effect距离比例（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）  （91.6-50）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距离比例×稀释度

12、对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。2、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-60 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875TC

13、ID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。实验五 血清中和试验一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。二、原理 抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。三、用途1、疾病诊断2、病毒分离株的鉴定3、不同病毒株的抗原关系研究4、疫苗免疫原性的评价5、免疫血清的质量评价6、测定实验动物血清中是否存在抗体四、分类(一) 蚀斑（痘斑）减数试验将病毒正常血清混合物以及病毒待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定

14、，比较病毒正常血清组和病毒待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。(二) 交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。（三）终点法中和试验1、固定病毒稀释血清法 将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合，置适当的条件

15、下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）。2、固定血清稀释病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。五、材料 1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）6、待检血清、PRV阳性对照血清、PR

16、V阴性对照血清六、操作步骤1、固定病毒稀释血清法1）测定病毒液的TCID502）将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。3）在96孔微量培养板中将血清（预先56灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50µl生长液，再加50µl待检血清，混匀后，吸50µl至下一孔，如此下去。一直到1256），每个稀释度作4孔。4）在上述各孔内加入50µl稀释好的病毒液，混匀后放入37 5%CO2培养箱中作用45min-60min。5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作 200个T

17、CID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50 4个不同浓度的对照。6）感作完成后每孔加入100µl细胞悬液，放37 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。 7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。血清稀释度CPE孔数无CPE孔数累计保护率%CPE孔数无CPE孔数12（10-0.3）04015100（15/15）14（10-0.6）04011100（11/11）18（10-0.9）131787.5（7/8）116（10-1.2）132466.7（4/6）132（10-1.5）315116.7（1/6）164（1

18、0-1.8）40900（0/9）1128（10-2.1）401300（0/13）1256（10-2.4）401700（0/17）距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率低于50%的保护率）=（66.7-50）/（66.7-16.7）=-1.2+0.33×(-0.3)=-1.299lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20=0.33  即120稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。2、固定血清稀释病毒法1）将病毒作连续10倍稀释2）将稀释好的

19、病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50l，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50l待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50l正常血清（对照组），混合后置37 5%CO2培养箱作用1h。3）然后在每孔中加入100l细胞悬液。4）设两纵排正常细胞对照。5）置37 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。6）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。中和指数=试验组TCID50 /对照组TCID50 如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。首先要纠正一下

20、错误的问题描述。正确的换算公式是1 TCID50 = 0.7 PFU你的病毒滴度为： 1012.3 TCID50/0.1ml = 1013.3 TCID50/ml （你好像没有理解TCID50的概念，请参考这里： 1013.3 TCID50/ml = 1013.3 TCID50/ml × 1又因为 1 0.7 PFU/TCID50, 所以1013.3 TCID50/ml = 1013.3 TCID50/ml * 0.7 PFU/TCID50 = 1013.15 PFU/ml空斑分析(plaque assay)是检测病毒感染颗粒滴度的一种常用方法。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml

21、，其中PFU(plaqueforming unit)表示空斑形成单位。它的优势在于可以直接用肉眼看到一个一个空斑（一些相信肉眼观察胜于可重复性的科学家非常乐意使用这个方法），但是它的重复性比较差（有时候是非常差），因此笔者强烈推荐采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。由于PFU又使用非常广泛，所以就涉及到PFU和TCID50 换算的问题。简单地说他们的关系是：1个TCID50 约等于0.7个PFU，即：1 TCID50 0.7 PFU例如某病毒的滴度为105TCID50/ml，那么它换算成PFU为：105TCID50/ml = 105TCID50/ml * 1 =105TCID50/ml

22、* (0.7PFU/TCID50) = 7*104PFU/ml如果你是只求知其然那种科学家，知道这一点就够了，没有必要往下看了，但是千万别记反了。如果你还想知其所以然，请继续看我的推演。我尽量做到深入浅出。我们知道1个PFU在理想的情况下代表一个病毒颗粒，但是实验过程中会出现两个（或多个）病毒颗粒粘在一起了，或者是它们感染了同一个细胞或两个非常相近的细胞，在形态上，只表现出一个空斑，所以在严谨意义上又不好说一个空斑就是一个病毒，只好换了个说法：将形成一个空斑的病毒颗粒的数量定义成空斑形成单位即PFU。事实上，1个PFU近似等于一个病毒颗粒。为了说明方便，在下文中我有时候也把一个PFU就说成一个

23、病毒（当然是有感染性的病毒颗粒）。根据TCID50的定义我们知道：用含有一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有50%的感染可能性。有的战友会说，那不就是：一个TCID50的病毒液体就是含有0.5个病毒了吗？又因为一个PFU约等于1个病毒，所以1个TCID50约等于0.5 PFU了吗？如果你理解到这一步，那恭喜你，你肯定不会把TCID50/PFU的换算公式记反了，但是这个理解和实际情况是有偏差的。回想一下，在TCID50试验结果中，我们只考察又多少个孔感染病毒，至于感染病毒的孔到底感染了多少个病毒形成了多少个空斑，并没有在计算结果中反应出来。换句话说一个感染了病毒的孔，它可能形成一个空斑，也可

24、能形成两个、三个等多个空斑。所以说一个TCID50含有的病毒的数量要比0.5个病毒多一点点，所以就有1个TCID50要略大于0.5PFU。那么到底大多少呢？别急，先恭喜你一下，你的理解有进了一大步！在进一步讲解这个0.7的近似值是如何计算出来之前，让我们来先回顾一下相关的数学概念。现在我设想有一个摇奖机：机器里面有20个大小完全相同的球，每次摇奖它可以掉出一定数量的球，那么它掉出1个，2个，3个，20个球的概率分别是多少？学过高中数学我们就可以知道掉出n个球的概率符合二项分布。如果忘记了，你可以复习一下，如果不想复习，也不妨碍继续看我的帖子。我简单说明一下，掉出1个和20个概率最小，渐渐地到掉

25、出10个和11个的概率最大。二项分布的概率函数图如下：现在我们设想另外一种情况：如果是一个装有20个球的捞奖桶，然后用一个一定大小的勺子去捞出一定数量的球，那么它捞出1个，2个，3个，20个球的概率分别是多少？如果我让你猜一猜捞出几个球的概率最大，聪明的你肯定可以想到那取决与我给你的勺子有多大，如果勺子适合捞出2.7个球，那么捞到3个球的概率最大。可以想象的是捞到20个球的概率几乎为0。同时我们知道捞出的最大概率的球数实际上还取决于勺子的大小这个参数。关于这个数学模型，现在我们来学习一下泊松分布：在二项分布的随机试验中，如果试验次数k很大，二项分布的概率p很小，且乘积= k*p比较适中，则事件

26、出现的次数的概率可以用泊松分布来逼近。具体的数学证明请看相关专业参考书。泊松分布的概率函数图如下：（cited from:维基百科：泊松分布）泊松分布的函数为：P(X=k)=e-*k/k!其中表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生频率。在温故了二项分布并知新了泊松分布之后，我们再回过头来看看我们要解决的生物问题。在TCID50试验中，一个孔形成非常非常多的空斑（即k很大）的情况的概率非常非常小（即接近0), 这种情况可以用泊松分布来逼近。解决生物问题的第一步是要把生物问题转化为数学问题。这一步是相当困难的！以下是TCID50实验结果转化为数学的描述

27、：根据TCID50的实验我们知道用一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有一半会感染，而另一半不会感染，换个说法就是：有一半的孔会出现至少一个空斑，而另一半的孔则出现0个空斑（即不感染），那么出现0个空斑的概率为0.5即：P(X=0)=e-*0/0! = 0.5我们知道0!=1, 0 1 所以：e-*1/1 = 0.5求得=-ln(0.5) 0.69终于看到了这个近似值是怎么来的了，可是这个又表示什么意思呢？泊松分布的函数为：P(X=k)=e-*k/k!其中表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生频率。这个描述比较抽象，我在网上找到了另外一个比较好的

28、解释（请参考这里：The Poisson parameter Lambda () is the total number of events (k) divided by the number of units (n) in the data ( = k/n). The unit forms the basis or denominator for calculation of the average, and need not be individual cases or research subjects.For examples, if we have 100 people, and o

29、nly 90 of them go shopping in a week then the binomial risk of shopping is 90/100 = 0.9. However, some of the people will go shopping more than once in the week, and the total number of shopping trips between the 100 people may be 160, and the Poisson Lambda is 160/100 = 1.6 per 100 person week.关于的解

30、释还是很抽象，但是他给了一个很好的例子。把例子翻译过来就是：在100个人中，只有90人每周去购物，那么单个人每星期去购物的机会为 90/100=0.9。然而一些人一个星期内不止去购物一次，而所有人的购物次数总和为160次。那么泊松分布的是160/100 = 1.6次/人/星期。如果再要求解一个人一周去购物两次的概率，就可以把1.6套入公式计算得到了。好！现在我们来类比一下：现有100孔细胞，每孔接入0.1ml病毒液，只有50孔会感染病毒并产生空斑，所以每孔细胞感染病毒的机会为0.5 （这是根据TCID50的定义来的）。然而一些感染病毒的孔可能不止形成一个空斑，所以这100个孔总共形成的空斑数目肯定>50, 假设它的数值为k, 那么k/100 个空斑/每孔。已经求得 = - ln(0.5), 所以-ln(0.5) = k /100k= -ln(0.5) * 100 70即 100个 TCID50 在理想状态下共可以形成-ln(0.5) * 100) (70) 个空斑。所以1个TCID50 可以在理想状态下可以形成-ln(0.5)个空斑，即：1 TCID50 -ln(0.5) PFU 0.7 P