温度依赖型性别决定的分子机制

1、生物学杂志JOU RNAL OF BIOLO GY1998年10月Vol. 15 No. 5温度依赖型性别决定的分子机制聂刘旺（安徽师范大学生物系，芜湖241000）#1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 生物学杂志JOU RNAL OF BIOLO GY1998年10月Vol. 15 No. 5#1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 生物学

2、杂志JOU RNAL OF BIOLO GY1998年10月Vol. 15 No. 5多数爬行动物缺乏异型性染色体，它们的性别不是在受孕时决定，而是由孵化卵的温度来决定的。温度依赖型性别决定的现象早在三十年前就被发现，但有关其机制的研究少有进展。在过去的几年里，由于 SRY基因的发现，对XY染色体（或遗传的）性别决定 （GSD）机制的分子基础的研究已取得重大进展。现今，比较TSD和GSD机制已成为可能。TSD已在一些 进化上较古老的脊椎动物中发现 ，由此人们推测它是 一种较古老的性别决定形式。而GSD机制由此进化而来。如果这一推测是正确的话，那么，这两种机制就可能共享了一个共同的分子途径。本文

3、对TSD机制的目前研究作了一介绍，提岀了一些必须解决的问题，以便更好地理解TSD机制的分子基础。1 TSD机制的概述：发育的胚胎所产生的最典型的结果之一是性别决 定。物种的延续依赖于胚胎分化形成雄性或雌性个体 的能力，因而，性别决定的机制一定是十分健全 。自然 界中，性别决定的机制有多种类型:1 1染色体（遗传型）性别决定;21环境性别决定。31孤雌生殖。环境性别 决定是指子代的性别归宿于胚胎发育的环境信号而不 依赖于合子的遗传组成。许多的遗传因子可以影响胚 胎的性别发育，如密度，含水量，pH值，最典型的是孵 化温度。TSD最主要的特点是较小的孵化温度的改变 能够决定子代是否为雄性或雌性。因而

4、，多数孵化温度下，子代的性比（8/ 8 +早）总是岀现明显的偏差。具有TSD现象的物种通常总是缺乏性染色体。目前，在几乎所有鳄类动物中均发现为TSD类型，龟类和蜴动物既有 TSD类型，又有GSD类型，而几乎所 有蛇类仅发现存在 GSD机制。美洲的密西西比鳄是 目前最被广泛研究的一种具TSD机制的动物，在这一动物中，30 C或低于30 C下的孵育温度将产生100 %的雌性，33 O产生100%的雄性，35 °C则产生大约 90 %的雌性，而其间的温度则产生不同的性比。这种雌雄一雌FMF型性别决定不仅在密西西比鳄 中存在，在其它具TSD机制的物种中也十分多见。亲缘关系较近的爬行动物种间，

5、即有GSD又有TSD机制的现象，使得我们可以相信，这两种机制的进 行过程可能是相似的，导致性腺分化的因子在哺乳动 物和爬行动物中可能是十分保守的 。因此，在爬行动 物中，已被分离和鉴定的具控制哺乳动物性腺发育的 基因可能在爬行动物中具有类似的功能 。通过对哺乳 动物性别决定分子遗传的研究，我们可以推断在TSD机制中的分子面貌。2爬行动物中与性别有关的特异DNA序列的发现如前所述，蛇类大多是雌性异配性别，性染色是ZW。Singh等于1980报道，他们在印度产的一种雌蛇 中（Bungarus fasciatus）分离到一种高度重复的卫星 DNA序列（B KM）。继后又发现BKM在海龟中也存在 性别

6、特异性；用BKM探针与原始种类的蛇如蟒科的Ergxjohni 和 Xenopeltis U nicolor 进行杂交时 ，发现这种与性别有关的序列散布在许多大型染色体上，这些原始种类的蛇没有异型性染色体，这类探针与小鼠染色体进行原位杂交，则显示位于雄性小鼠Y染色体近着丝粒区，因而人们推测BKM在脊椎动物性别决定机 制中起一定作用。研究表明，BKM具有许多GATA或 GACA的重复单位，它们在性反转小鼠中Xsxr区段与编码睾丸决定基因（Tdf）的序列相连，因而，表现为随 Tdf而被动转录；丫染色体上靠近 Tdf位点的GATA 重复序列的大小似乎相当随机而与性别决定无关；人类的Y染色体上几乎不含这

7、一序列更加证实B KM与性别决定关系不大。3爬行动物H2Y抗原基因H2Y抗原是一种雄性特异的组织相容性抗原，在脊椎动物的进化过程中高度保守，广泛存在于人和脊椎动物的异配性别中（XY型性别机制中存在于雄性 中;ZW则存在于雌性中）。Zaborski等于1970年提出， H2Y抗原在龟类中是睾丸决定因子（Tdf），而温度可使这种蛋白的作用发生逆转。然而，对H2Y抗原以及这种性逆转龟（Siebenrockiella crassicollis ）的进一步研究 表明，其雌性为 H2Y阳性，而雄性却为异配性别（XY型）。从而否定了 H2Y抗原基因是Tdf。Bull也从理论 背景上进行了阐述，他认为如果TS

8、D机制是从GSD机 制（XX/XY型）进化而来的话，那么在转变成 TSD时， 要么X染色体要么Y染色体可能会丢失，从而TSD种 类不存在有异配性别；之后的文章中，他进一步认为两 种性别间没有遗传差异是ESD机制的先决条件。但实事上，爬行动物仍然具有H2Y抗原，且仍为雄性特异抗原。Mardon等在对一种性反转小鼠的实验结果表 明，虽然性反转小鼠（XXsxr）仍有睾丸，但却检测不到 H2Y原，也否定了 H2Y抗原的理论。近年的实验表明,H2Y抗原基因位于小鼠Y染色体的短臂上，与小鼠Tdf紧密连锁，但并非同一基因。 对人类性反转患者的研安也表明H2Y抗原位于人类Y染色体的长臂上，而人类TDF则位于Y

9、染色体的短臂 上。进一步研究还发现人类X染色体上也存在同源基因Zfx，因此，现在人们倾向认为,H2Y抗原是一种重要 的睾丸分化因子，但不是唯一的和主要的睾丸诱导因 子。4爬行动物ZFY基因的研究一般认为,ZF Y基因所编码的锌指蛋白是一种转 录因子，在基因转录水平上，与DNA结合，可能起调控 睾丸的作用。鉴于这一推测，早在1988年,Bull等采用 人类的ZFY探针pDP1007与几种爬行动物的基因组 DNA进行了杂交检测，发现爬行动物中存在ZFY同源序列。这种保守性和广泛性也得到了Valleley等的证实。他们克隆了密西西比鳄的ZFY同源基因Zfc ,并进行了序列测定，结果显示，在氨基酸水平

10、上,ZFY和Zfc 具有91 %的同源性。这种同源性说明了由这一基因编 码的功能也具有同源性。1994年Spotila等从蛇鳄龟（Chelydra scrpentina ）中也克隆了该基因 （Zfc）,序列分 析与人、小鼠、家鸡、鳄类均具有较高的同源性，DNA序列的同源性从80 % -98 % ,氨基酸序列的同源性从65 % 96 %。鳄类和龟类中，其两性性别均发现有 ZFY同源基 因的存在；其表达研究表明，鳄类在胚胎发育期间，多 个组织中均有该基因的活性表达，没有证据表明Zfc有 性别特异性的功能。因此，它在TSD机制中的作用尚 不清楚，它不是性别决定的主要信号，而是可能在性别 分化的级联作

11、用中担任某一角色或是作为一般的转录 因子。5爬行动物SRY基因的研究SRY是目前大家公认的TDF最佳候选基因。 1991年，Tiersch等利用哺乳动物SRY保守基序区的一个探针对多种脊椎动物进行了杂交分析，性别特异的杂交带仅岀现在人和哺乳类、而在鱼类、鸟类、爬行类和无颌类等雄性和雌性中均有一致的杂交带，没有性别特异性，在爬行动物中，具有GSD或TSD的种类 间也无性别特异的杂交带型。迄今，已有两种具有TSD 机制的爬行动物（Alligator missippiensis 和 Chely2 dra serpentino ）进行了 SRY2box基因的克隆和序列分 析。在鳄类中,SRY2box基

12、因主要有三种类型，其相似性分析表明，它们与小鼠SOX基因的相似性程度比与 人类SRY基因或小鼠Sry的相似性程度更高，这种相 似性可能反应了功能上的同源性，至于对性别决定的作用，尚需进一步研究，Spotila等从龟类中克隆的 SRY2box基因也具有上述同样的特点。他们在龟类中克隆到10个SRY2box基因（Sra）,它们与鸟类（Larus fuscu©等的SRY2box基因（由常染色体编码）也具有较 高的同源性，其范围从40 % 81 %。最近，作者对中国 产三种龟类（平胸龟 Platysternon megacephalum、乌龟 Chinemys reevesn、中华鳖 T1

13、sinensis）的 SRY2box 基因 进行了初步研究。采用能特异扩增男性SRY保守序列的一对引物对三种龟进行PCR扩增，该引物能特异扩增SRY基因的开放阅读框架，扩增产物为 482bp。结果显示，三种龟的PCR扩增产物与人的一致，也为 482bp。该产物经过southern转移能与SRY探针 p Y53. 3特异杂交，且只显示一带。PCR产物经单链构 象多态检测表明，中华鳖和平胸龟的雄性和雌性间没 有大小差异；鸟龟在两性间的差异不明显，三种龟与人 （男）的片段差异也很小。表明该序列在人和龟类中相 当保守，其同源性大小和在性别决定中的作用则尚待 研究。爬行动物的SR Y2box基因在胚胎发

14、育过程中的表 达研究进行得较少。目前仅在美国密西西比鳄中进行 过有关研究，他们采用PCR产物作为探针，以检测鳄 类SR Y2box基因的胚胎表达和一些组织特异性，结果表明，从胚胎发育的第3、16和20期（stages）取得的胚胎总mRNA与探针杂交没有显示有发育时期的特异371994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 生物学杂志JOU RNAL OF B IOLO GY1998年10月Vol. 15 No. 5性，而在不同的组织中，同一发育时期的组织表达差异 也不明显。在人

15、类中,SRY基因只在睾丸组织中表达，而在卵巢、肺和肾中均不表达，此外SRY虽然在成年 期睾丸组织中持续地表达，但迄今并未发现有与期在 生殖嵴中类似的功能活性，这充分说明SRY基因的表 达具有空间和时间特异性。一般认为,SRY是一种转录因子，通过对其它基因的表达调控而对雄性性别的 分化起开关作用。爬行动物中，SRY2box基因的表达 未见有类似哺乳动物SRY基因表达的时、空特异性,因而其在性别决定中的作用有待进一步研究。6爬行动物TSD的分子机制目前为止，关于TSD分子机制，国外学者作了不 少工作，现主要有以下几种观点：611 构象改变(Conformational change)学说Johns

16、ton (1995)认为，温度会影响 SRY蛋白的表达或活性，从而激活雄性性别分化途径或抑制雌性分 化途径。这一假说的实验基础来自于对美国密西西比 鳄(FM型)的研究。该种的雄性决定基因的表达是温 度依赖型，在较高的孵育温度下，性别决定的敏感时期 中，一些基因的产物过度表达，从而确定了雄性发育,而在较低温度时，这些基因的产物含量则较低。这些过度表达的产物作用途径是什么以及功能如何迄今尚 不清楚。构象改变学说似可解释FM型或MF型TSD机制。但对FMF型性别决定来说，温度对构象的改变 则至少有两种形式。如美洲产的一种鳄中，孵化温度 在31 C以下和35 C以上均发育成雌性，中间温度则为 雄性。J

17、ohnston推测，在这样的一些种类中，决定雄性发育的蛋白构象可能要求十分严格，只有在适合的温度下，才能产生雄性发育的特异构象；而对于雌性发育 而言，其构象的改变影响不大。因而，仅在某些范围较 小的温度下孵育才能产生雄性，而雄性则在多种温度 下可以产生。612 阈值假说(The threshold hypothesis)Deeming (1988 ,1989)认为睾丸的发育依赖于胚胎 发育关键时期雄性决定因子(male determin factor MDF )的产生，在适宜的温度下,MDF的积累达到某一 阈值水平就发育成雄性，若达不到就发育成雌性。这 一假说可以解释某些种类在一特定温度下，胚

18、胎即可发育成雄性又可发育成雌性的现象，这可能是不同的胚胎产生MDF的速率不同而导致的。Smith (1994)对密西西比鳄的胚胎性腺发育观察表明，在发育的特定阶段，足细胞(sertoli cell)的阈值数量达到一定值后，胚 胎就发育成雄性，否则就发育成雌性，因此，足细胞可 能就是MDF。然而，TSD机制可能比上述的情形更为复杂，研究 表明与雌性决定因子 (Female determing factor , FDF)也 有关。在受精卵开始孵化时，所有胚胎都具有发育成 雄性或雌性的潜能，如果在温度敏感期之前，FDF己积 累到某一阈值水平，胚胎就发育成雌性，而此后的温度 变化将不会产生影响。这一推

19、测可用孵化卵的温度变 异试验来证实。如某些鳄类(MF型,33 'C以下为雌性, 30 C以下为雄性)产下的卵，在温度敏感期之前，先孵 育在3435 C ,而在温度敏感期转移到30 C以下来孵化对某些胚胎性别无影响，子代总有一定数量的雌性 个体，这可能就是在3435 C时,FDF产生较快，积累 值已经达到一定水平的缘故。613类固醇激素效应4$!5'肆腹.i-!忌;-:I!.-r!: =!ri 1 -*: : '-:/:=!Jt.».:!:?A:;:-I.JL-fi1=_!.- r - - - -ITCH-. * . . .1. . :_: lB .- 5 ：

20、=:I :BI:,. -a ! . .: . -.I ".I 1>- . ZleiuE務灯it曲f edf 1 a!iry dirlidn:sign工FTirt*r，r!¥-h-pe图1鳄类在三种不同温度下性别决定的模式fig2 The hypothetical schemes of sex determination of Alligator at three different temperature发育中的胚胎用激素处理可改变性腺的分化 (Johnston ,1995)，在产生雄性的温度下，雌二醇可刺激卵巢的分化。两种龟类的研究表明(Gutzke , 1988

21、; Wibbels ,1991),类固醇的敏感时期与温度的敏感时期 大致平行且对性别决定有协同效应。睾酮也可诱导卵 巢发育，这是由于睾酮芳构化(aromatization)成为雌二醇。非芳构化的雄性激素对性腺分化产生雄性效应。这些实验表明，具TSD的爬行动物雌性的发育是一个 被动状态，一些条件作用于它可诱导雄性的发育，这与雄性发育是由于特殊因子的积累是一致的。类固醇激素有两个效应:(1)外界条件不适于MDF的迅速积累时,胚胎发育成雌性(2)如果温度和雌二醇具有共同371994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. Al

22、l rights reserved. 生物学杂志JOU RNAL OF BIOLO GY1998年10月Vol. 15 No. 5的生理途径，则激素可促使雌性的发育。614温度修饰模型Spotila等(1994)认为，TSD机制是一种未分化的性腺发育的修饰过程，这种修饰过程归因于一个或多 个特异DNA序列的差异表达，而这种表达又受到某一 温度敏感的过程或类似于蛋白一样分子的基因产物不 同作用所控制。图3为TSD的一个模型，该模型认为 温度作为修饰剂(媒介)改变了 X分子的空间构型，在 产生雄性的温度上,X结合到增强子上，这样就大大刺 激了基因转录，产生大量的睾丸分化所必需的基因产 物，而在雌性

23、产生温度下，分子X有不同的构型，其不 能与增强子结合，从而仅有少量的基因产物，性腺则发 育成雌性。图2 TSD机制作用的机理模Fig3 The pattern of the temperament madifying上述的假设模型虽没有直接的证据，但已有一些实验结果是支持的:(1)在性别决定的温度敏感时期 (指性腺从未分化到开始性别分化的转变时间)(ther2mosensitive)有多种内源类固醇类激素和促类固醇生成 的酶存在。(2)大量的研究显示外源类固醇激素处理，能够掩盖温度的作用，诱导卵巢或睾丸的发育。(3)对龟类(M aloclemys Terrcpin. TSD)的实验表明，p45

24、0 芳 香化酶(Aromatase )抑制因子能显示破坏卵巢的分化。(4)有一些证据认为雌激素和温度可能作用在同一生 理途径上。(5)对E1 orbicularis的研究表明，在诱导雌 性产生的温度下，性腺中雌激素量比诱导雄性产生的 温度中的要高得多，且芳香化酶的活性也要高许多，这 是由于在雌性诱导温度下，芳香化酶大量产生的缘故。对于芳香化酶基因表达的调控，虽然在爬行动物中尚 未进行研究，但来自哺乳动物研究结果，则显示其与SRY基因有关。因此,TSD机制似乎也和哺乳动物一 样，由温度引起SRY的表达，从而启动性腺发育的一 系列级联作用。对于上述的假设，尚有许多问题需要解决，首先是 温度变化如何转变成分子信号?这种信号的受体是什么？它的传递途径如何 ？等等。因此，这一问题的研 究不仅可解决爬行动物性别决定机制，也会使人类性别决定之谜得以解开。TSD和GSD两种机制在分子不平上的一致性尽管目前对TSD机制的细节尚不清楚，然而越来