DGGE操作步骤

1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺1.07gMilliQ（超纯水） 水加到100mL溶液采用0.45m滤膜过滤，储存在42、0的变性储存液凝胶梯度68101240%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50TAE缓冲液2mL2mL2mL2mLMilliQ 水83mL78mL73mL68mL总容积100mL100mL100mL100mL3、100的变性储存液凝胶梯度68101240%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL50TAE缓冲液2mL2

2、mL2mL2mL去离子甲酰胺40mL40mL40mL40mL尿素42g42g42g42gMilliQ 水加到100mL加到100mL加到100mL加到100mL4、50TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g2M冰乙酸57.1 ml1M05M EDTA，pH8.0 100.0mL50mMMilliQ 水加到1000.0mL 将溶液混合溶解，121下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8固定液（250 ml）：乙醇 200 ml冰乙酸 10mlMilliQ 水 40ml （A）：1固定液（400 ml）：8固定液 50mlMilliQ 水 350ml（B）银染溶液

3、(400ml)：AgNO3 0.6gMilliQ 水 300ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 4.5gMilliQ 水 300 ml 甲醛 0.9ml6、10过硫酸铵（APS）：过硫酸胺 0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45m微孔滤膜过滤，4保存，保存时间为1周。7、10ml DGGE加样缓冲液：2溴酚蓝 0.25ml2二甲苯青 0.25ml100甘油 7 mlMilliQ水 2.5ml二、不同引物的变性梯度1,乳杆菌（380bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65（12ml）4.8ml7.

4、2ml13ul56ul2,双歧杆菌（596bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul70（12ml）3.6ml8.4ml13ul56ul3,肠球菌（300bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40（12ml）7.2ml4.8ml13ul56ul55（12ml）5.4ml6.6ml13ul56ul4,V3 region（217bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35（12ml）7.8ml4.2ml13ul56ul65（12ml）4.2ml7.8ml13

5、ul56ul60(12ml)4.8ml7.2ml13ul56ul5,V6-V8 region (489bp）变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵42（12ml）7ml5ml13ul56ul58（12ml）5ml7ml13ul56ul浓缩胶：0%变性储存液 7ml， TEMED 8ul， 10%过硫酸铵 36ul三、实验操作1封槽（1）用95 %乙醇擦净清洗一大，一小两块玻璃板，干燥。（2）用95 %乙醇清洗两个间隔条，并将其置于大块玻璃板两侧边缘，外边缘与玻璃板边缘相齐。（3）将小块玻璃板置于间隔条上，对齐，并用夹子固定这个“sandwich”。2胶的制备用不同体积

6、的两种变性剂和丙烯酰胺贮存液配置变性剂要求浓度的胶。经验上讲，胶的体积以刚好覆盖胶板为宜。本实验V3区扩增产物DGGE采用65%和35%的变性剂浓度溶液；乳杆菌特异序列扩增产物DGGE采用60%和35%的变性剂浓度溶液。配置方法如下：不同引物的变性梯度0100总体积0% 7mL0mL7mL35%7.8mL4.2mL12mL40%7.2mL4.8mL12mL50%6.0 mL6.0 mL12 mL60%4.8 mL7.2 mL12 mL65%4.2 mL7.8 mL12 mL(1)清洗梯度合成器并使之干燥，并关掉两个槽之间的活栓。(2)干燥梯度合成器的槽。(3)分别向两个浓度的变性剂溶液中加4.

7、5 L /mL 10% APS(过硫酸铵)和1L/ mL的TEMED（四甲基乙二胺），搅拌均匀。(4)把高浓度变性剂溶液加到梯度合成器右边的槽中，低浓度变性剂溶液加到梯度合成器左边槽中。(5)将连接梯度合成器的出口针头置于胶板之间并固定。(6)推动梯度形成器形成的梯度分离胶即注入两层玻璃板之间。在混合和灌胶时应避免产生气泡。(7)分离胶灌完后，取出针头，将其置于一个锥形瓶中，并停止搅拌。(8)冲洗梯度合成器的两个槽，打开泵，排出其中水分。(9)在浓缩胶中加入10% APS和TEMED并将浓缩胶灌入两层的玻璃板之间。(10)待浓缩胶充满后，在其顶部插入梳子（避免产生气泡），放置1 h。3电泳(1

8、)在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60 。(2)取掉梳子，用蒸馏水清洗没有凝聚的胶,并将sandwich固定在电泳槽内。(3)调节缓冲液的高度，使其刚刚超过胶上的加样孔。(4)用缓冲液清洗加样孔（注射器及针头）。(5)向胶顶部的加样孔中加入PCR的产物。(6)盖上电泳仪的盖子，打开开关，电泳 220 v，10 min， 随后85 v ,16 h。4染色(1)电泳完成后将胶取出置于一个干净的不锈钢或塑料容器中，水洗3次。(2)加入400 mL 1固定液，摇3 min。(3)将固定液倒入在容器中（后面操作使用）。(4)添加200 mL银染溶液在摇床上摇20 min。(5)弃去银染溶液，用蒸馏水轻洗胶3次及容器。(6)添加新鲜蒸馏水 摇1-2 min。(7)弃去蒸馏水，添加少量显影溶液，摇一会儿，直至出现清晰条带为止。(8)弃去显影溶液，加入使用过的1固定液，摇5 min。(9)弃去固定液。(10)加入蒸馏水摇2 min,后弃去蒸馏水。(11)取出胶并置于一个洁净的玻璃板上，干燥，照相。5注意事项：(1)DGGE电泳中使用有高毒性和致癌的一些试剂，故在实验过程中应注意加强自身的保护，如带手套等。(2)灌胶的时候避免产生气泡。(3)银染溶液不能随便放弃，以避免造成环境污染，