westernblot操作步骤

1、western blot操作步骤2012版2012-02-03 00:00   来源：丁香园   点击次数： 4016 关键词： western blot 操作步骤 分享到： 收藏夹 腾讯微博 新浪微博 开心网 文转载于丁香园站友dlzhangyu的论坛大作，点此查看详情，感谢dlzhangyu站友的分享。2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像

2、Endnote那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的western条带了，所以相信你也行。为了节省时间，鄙人总结了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是

3、DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。一、蛋白质的样品制备：由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:> 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。> 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶

4、液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。> 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。> 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。> 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。二、

5、蛋白质定量如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading bu

6、ffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮35min使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在4冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。三、SDSPAGE电泳1. 清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应

7、用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。2. 灌胶与上样 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，

8、操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加1cm）。 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鲜的话加再多的TEMED效果

9、也不佳，这就是为什么推荐APS每周新鲜配置的原因。 按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合1X SDS loading buffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95100°加热5min，若有沉淀可用稍低温度，比如455

10、5°加热1h达到变性的目的。我一般习惯分装20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，临用前用PCR仪加热95°C 5min，效果不错。 胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的MV-III型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。加样前可用5ml注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外

11、槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。目前我们做的mini胶上有10个上样孔，一般在第一个孔加入marker（我用的是Fermentas预染marker），其余9个孔加入样品，也可在头尾孔内加入marker，中间8个孔加样品。加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用10ul的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝

12、胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在分子克隆上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印90kd以下的蛋白，转膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037%的SDS。1. 在电泳结束前20min开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.18.3cm，宽度根据裁的胶大小

13、实际测量，但胶一般会缩水，所以裁8cm就行）和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min2min。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。也可取10ml注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者

14、自然分开。取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择，一是按照marker指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸，平衡10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜（此时可在PVDF右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每

15、叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做western的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。4. 依据分子量大小电泳156

16、0min。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合PVDF膜）。将膜晾干备用。使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。五、免疫杂交反应

17、1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜，具体原因可以参考这个帖子：2. 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用TBST稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀释倍数为1:200，1:500，1:1000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用23次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。稀释后应在23天内使用，4度保存，避免反复冻融。）；撕下适当大小

18、的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（4080元一个）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后转移到室温下再孵育1h（或者4°孵育过夜），用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗几次，比如4次，每次5min。3. 在培养皿内加入二抗稀释液（10ml足够了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀释），放在摇床上，室温

19、下孵育12h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。六、化学发光（ECL），显影，定影1. 现在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上。将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合（注意吸完A试剂后吸B试剂前要患枪头），然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应12min后，将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后转移到在X片夹

20、中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到2min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（也有人重叠压好几张片，固定曝光510分钟，从这好几张片中选出最合适的底片）；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025

21、），温度过低时（低于16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干（注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）。X光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMATBT胶片 。显影液和定影液最好每周配置一次，避光室温保存，显影和定影液是最便宜的试剂了，千万不要因为它而影响了整个结果。七、凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如bio-rad的Quantity One。如何使用请看这里。主要参考资料：1

22、、WB实战指南+正确使用Quantity One定量 by jacqueslm2001 2、Abcam的western新手指南 3、土豆网的western blot视频 上海交大出品 4、分子克隆实验指南精编版 化学工业出版社5、抗体技术实验指南科学技术出版社6、milipore的western blot的优化方案 7、Western blot步步看(网络流传最广的资料) 作者不详 8、Bio-rad 蛋白印迹手册 9、穷人的劳斯莱斯-我的五年western blot体会 by seagate 附：Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的时间规划）前期准备

23、：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDS loading buffer混合，已经分装好，保存与-20°。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。8:00 从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。混合均匀并离心。8:30 取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的枪加样。9:00 开始电泳。恒流30mA一般1个小时足够了。9:30 开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。10:10 电泳结束

24、（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。11:00 转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。12:00 转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。开始封闭1h。13:00 封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37° 1h然后在室温（23°左右）再1h。15:00 一抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min。15:30 开始孵育二抗。室温1h足够了。

25、16:30 二抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min，这里推荐采用5*6min。17:00 ECL发光，压片10min，显影1min，定影10min，那么在18:00之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般20min就行，然后洗涤几次，重新封闭1h，然后一抗过夜，明日在继续战斗。这样的话18:30之前也能结束战斗了。 Western Blot(免疫印迹法)（图）主要包括以下 4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫杂交与显色蛋白检测。溶液和试剂1.

26、1X 磷酸盐缓冲液(PBS)2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA:1 mM ;PMSF: 1 mM;Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM;NaF: 1 mM3. 1X SDS 样品缓冲液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚蓝4

27、. 转移缓冲液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris缓冲盐 (TBS)：准备1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl调pH为 7.67. 甲醇8. TBS/T缓冲液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封闭缓冲液（TBS/T）：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA10. 一抗的稀释：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脱脂奶粉( 单抗)。Note： 一般来说，BSA被推荐用于多克隆抗体，脱

28、脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率。样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为 定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1培养细胞或药物处理。2弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate,100l /w或 75 cm2 plate,500- 1000l/瓶) ，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。4超声 1015秒剪切DNA以减低样品粘性。5煮沸样品5 minutes。6离心12000g，5 min，取上清

29、。7电泳分离：上样15l20l 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平， 应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2  flask)裂解细胞， 收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀415min，14000g离心15min（4），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样2030 g已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量 至100g，但电泳条带

30、易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜杂交膜的选择是决定 Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转 移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起， 但在非离子型的去污剂作用 下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔 径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，

31、膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。 通常用 0.45 m 和 0.2m 两种规格的 NC 膜。 大于20kD 的蛋白可用 0.45m 的膜， 小于 20kD的蛋白就要用 0.2  m 的膜了， 如用0.45 m 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低 分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易， 转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的 操作步骤。1. 将胶浸于转

32、移缓冲液中平衡 10min。 注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6 片， 放入转移缓冲液中平衡10min。 如用P VDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。3. 装配转移三明治： 海绵 3 层滤纸 胶 膜 3 层滤纸 海绵， 每层放好后， 用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液， 插上电极，100V，1h（电流约为 0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜免疫杂交与显色1用25 ml TBS

33、洗膜5min，室温，摇动。2置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。315mlTBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。515 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二 抗，室温孵育1h，缓慢摇动。715 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。815 ml TBS洗1次。9蛋白检测( 显色法或发光法，按相应试剂说明操作) 。注意事项：1操作中戴手套，不要用手触膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。3如检测小于20kD的蛋白应用0.2m的

34、膜，并可省略转移时的平衡步骤。4某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。5关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.33% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。6如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。7如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。Western Blot免疫印迹实验操作规程Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知

35、表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平

36、的表达。二、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见电泳实验。2. 匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4  0.24g；加ddH2O至1000ml。5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5

37、%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6. 显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H2O2 1.0l。三、操作步骤1. 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4，13,000g离心15min。取上清液作为样品。2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。3. 转移：（半干式转移） 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜

38、缓冲液中10min。 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2 ，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。四、免疫反应：1. 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。2. 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。3. 弃包被液，用0.01

39、M PBS洗膜，5min×3次。4. 加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。5. 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。6. 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M  PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。7. 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。8. 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。四、注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，在同一个抗体公司，可能会有好几种，甚至好几十种；在不同的抗体公司，那就更多了。那怎样在琳琅满目的抗体中，选择自己实验需要的抗体呢？主要考虑如下几种因素：分析自己实验应用的实验方法是哪种？分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？分析样本中的蛋白质的结构性质，分析抗体的标记和检测，分析抗体的宿主来源种属