Hnrnpk与c-Src互作及对C2C12细胞增殖分化的影响

1、Hnrnpk 与 c-Src 互作及对 C2C12细胞增殖分化的影响核不均一核糖核蛋白k (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein k,Hnrnpk) 是一个多功能蛋白 , 参与 DNA修复、转录和翻译调控、 RNA的剪切加工等生物学过程 , 能通过多种途径对成肌细胞增殖与分化起重要调控作用, 但其作用机制及信号通路尚不清楚。c-Src 作为非受体蛋白酪氨酸激酶家族的一员, 可以通过 Rat/MEK/ERK和 p38MAPK信号通路对骨骼肌肌生成过程起着重要的调节作用,但其在成肌细胞中的表达调控机制却不清楚。以往研究表明 Hnrnpk 与 c-Src 存

2、在多层次的互作并发挥重要生物学功能。本研究从猪 Hnrnpk 和 c-Src 基因的克隆及表达着手 , 以小鼠 C2C12成肌细胞为模型 , 结合 qRT-PCR、免疫印迹、细胞转染、亚细胞定位、免疫荧光、过表达、RNA干涉、Co-IP 、GSTpull-down 、酵母双杂交、RIP 等方法 , 深入探讨 Hnrnpk 与 c-Src的互作及其在 C2C12成肌细胞增殖分化中的作用, 这将为阐明骨骼肌发育和再生的复杂网络调节机制奠定基础, 而且还可望为畜牧业提高动物的产肉量、肉品质及医学上控制肌肉再生提供理论依据。本研究得到以下结果： 1. Hnrnpk 基因的克隆及时空表达分析克隆得到20

3、56bp 猪 Hnrnpk 基因的 cDNA序列 , 包含 1395bp 的开放阅读框 , 编码 464 个氨基酸；Hnrnpk 基因在梅山猪不同发育时期的背最长肌中均差异表达, 胚胎期表达量最高 , 并且随着生长发育呈下调表达。Hnrnpk 基因在 120 日龄的大白猪肌肉和脂肪组织中相对高表达 , 肾、肺中次之 , 心、大脑、肝、脾和卵巢中的表达相对较低。而就四种不同类型肌肉组织而言, 半腱肌和背最长肌中表达量最高, 咬肌次之 , 股二头肌中最低； Hnrnpk 基因在 C2C12细胞分化过程中表达下调, 其直接调控的 c-myc、c-Src 、p21 等基因表达趋势与之相似。2. c-S

4、rc基因的克隆及时空表达分析克隆得到4126bp 猪 c-Src 基因的 cDNA序列 , 包含 1629bp的开放阅读框 , 编码 542 个氨基酸； c-Src 基因在大白猪和梅山猪肌肉中的表达模式相似, 均在胚胎 65 日龄高表达 , 出生后 3 天表达量极显著减少 , 而在 21 日龄又表达上调 ,此后随着发育逐渐下调；两品种相比, 胚胎 65 日龄 ,c-Src基因在梅山猪中的表达量显著高于大白猪 (P<0.05),而出生后 3 天、 21 天及 6 月龄大白猪中的表达量均极显著高于梅山猪(P<0.01);c-Src 基因在猪不同组织中广泛表达, 在PT期

5、, 大脑中 c-Src 基因的表达量最高 , 肝脏中表达量最低。在 3 天, 肝脏中 c-Src 基因的表达量最高 , 骨骼肌中表达量最低。在4 月龄 ,肺中 c-Src 基因的表达量最高 , 骨骼肌中表达量最低；在C2C12细胞诱导分化过程中 ,c-Src基因随着诱导分化表达先上调后逐渐下调。3. Hnrnpk 对 C2C12细胞增殖分化的影响超表达Hnrnpk 基因后 , 成肌转录因子 MyoG,Myf6 的表达量下调 , 而 MyoD却上调 , 成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、MCK、TAK1下调 ,c-Src表达量上调 ,p21 下调；siRNA 干涉 Hnrnpk 后, 成肌转录因

6、子 MyoG、Myf6 和 MyoD以及成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、 MCK表达量上调 ,c-Src 表达量下调 ,p21 上调。表明 Hnrnpk 可能通过上调 c-Src 和下调成肌转录因子 MRFs家族的表达从而促进 C2C12细胞增殖或抑制分化。4. c-Src 对 C2C12细胞增殖分化的影响超表达 c-Src 基因后 , 成肌转录因子MyoG、Myf6 、MyoD的表达量下调 , 而且成熟骨骼肌相关分子标记物MLC2、MCK、TAK1表达量下调 ,p21 表达量下调； PP2抑制剂处理 C2C12细胞后 ,MyoG和 MyoD分化标记基因、 p21、凋亡基因 Caspase3

7、 表达量均上调 ,p53 和 c-myc 基因下调表达 , 而 c-Src 表达没有变化。表明c-Src 对 C2C12细胞增殖分化发挥作用可能是通过直接或间接调节成肌转录因子MRFs家族和 p21 的表达来实现的。5.Hnrnpk 与 c-Src 的互作分析通过 ELM在线分析发现与Hnrnpk 相互作用的众多元件包括了c-Src 蛋白的 SH3结构域 , 进而采用 Co-IP 初步证实内源性的Hnrnpk 和 c-Src 在分化的 C2C12细胞中相互作用；此外 , 又用酵母双杂交和GSTpull-down方法对 Hnrnpk 与 c-Src 的互作进一步分析 , 酵母双杂交结果表明Hnrnpk 与 c-Src 的全长以及单独的SH3结构域互作 , 与其他缺失体不互作 , 与c-Src 全长的结合活性要强于单独的SH3结构域；GSTpull-down 结果表明 Hnrnpk能够在体外与 c-Src 的全长及所有缺失体相互作用。RIP 实验结果表明分化的C2C12细胞中 c-Src mRNA与 Hnrnpk 的结合能力要极显著高于阴性对照IgG 抗体(P<0.01),而增殖的 C2C12细胞中 c-Src mRNA和