课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。 土壤中的土壤中的细菌细菌将尿素将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、 梭状芽孢杆菌，

2、某些真菌和放线菌也能分解尿素。梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌 统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌课题背景课题背景CO（NH2）2 2NH3 CO2 H2O脲酶脲酶一、研究思路一、研究思路（一）筛选菌株（一）筛选菌株筛选菌株、统计菌落数目、设置对照筛选菌株、统计菌落数目、设置对照 （一）筛选菌株（一）筛选菌株 1、实例：、实例： PCR技术技术DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一种在是一种在体外体外将少量将少量DNA大量复制（大量复制（PCR）的技

3、的技术，此项技术要求使用术，此项技术要求使用耐高温耐高温（93 ）的）的DNA聚合酶。聚合酶。去哪里找？为什么？去哪里找？为什么？原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度7080，淘汰了绝大多数微生物，淘汰了绝大多数微生物， 只有只有Taq细菌被筛选出来细菌被筛选出来。启示：启示：寻找寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的要求，时要根据它对生存环境的要求， 到到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。热泉热泉 2、实验室中微生物的筛选、实验室中微生物的筛选（1）原理：）原理： 人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件（包括营养、生长的条件（包括营养、 温度、温度、pH等），同时抑

4、制或阻止其他微生物生长。等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）方法：）方法： 抑制大多数微生物的生长；抑制大多数微生物的生长； 促进促进目的菌株目的菌株的生长的生长（3）结果：）结果： 培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过 稀释涂布平板法稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离等方法对它进行纯化培养分离。一、研究思路一、研究思路（一）筛选菌株（一）筛选菌株3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：思考：思考：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基固体培养基在此培养基中哪

5、些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素从用途看此培养基属于哪类？从用途看此培养基属于哪类？ 选择培养基选择培养基允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻抑制或阻止其他种类止其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基。选择培养基。能筛选出哪类微生物？为什么（或如何进行筛选）？能筛选出哪类微生物？为什么（或如何进行筛选）？培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有，只有能合成脲酶能合成脲酶的微生物才能分解的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶缺乏脲酶的微生物

6、由于不能分解尿素，的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。所以用此培养基就所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物能够选择出分解尿素的微生物。KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g尿素尿素1.0g琼脂琼脂15.0g一、研究思路一、研究思路（一）筛选菌株（一）筛选菌株怎样证明此培养基具有选择性呢？怎样证明此培养基具有选择性呢？一、研究思路一、研究思路（一）筛选菌株（一）筛选菌株以尿素为唯一以尿素为唯一氮源的培养基氮源的培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素细

7、菌尿素细菌判断该培养基判断该培养基有无选择性有无选择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否接种是否接种目的目的结果结果只生长只生长尿素细菌尿素细菌生长生长多种微生物多种微生物是是组别组别（二）统计菌落数目：（二）统计菌落数目：想一想：你在必修想一想：你在必修3学习了哪种测定微生物数量的方法？学习了哪种测定微生物数量的方法？ 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数： 利用利用血球计数板血球计数板（血细胞计数板血细胞计数板），在，在显微镜显微镜下下 计算一定容积里样品中微生物的数量。计算一定容积里样品中微生物的数量。 缺点：缺点：不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的

8、计数；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；一、研究思路一、研究思路（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目2、活菌计数法、活菌计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1）原理：）原理：在在稀释度足够高稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成时，微生物在固体培养基上所形成的的一个菌落一个菌落是由是由一个细胞一个细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表一个菌落代表原先的一个活细胞（活菌）原先的一个活细胞（活菌）。（2）公式：每克样品中的菌落数（）公式：每克样品中的菌落数（CV）M其中，其中，C代表某一

9、稀释度下平板上生长的平均菌落数，代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL） M代表稀释倍数。代表稀释倍数。一、研究思路一、研究思路（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落的培养基中测得平板上菌落数的平均数为数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为平板时所用稀释液的体积为0.1mL） （ ）A. 2.34108B. 2.34109C. 234D. 23.4 B练习练习公式：每克样品中的菌落数（

10、公式：每克样品中的菌落数（CV）M其中，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），）， M代表稀释倍数。代表稀释倍数。一、研究思路一、研究思路（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目说明设置重复组的重要性。说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定在设计实验时，一定要涂布至少要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性与准确性。在分析实验结果时，。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复一定要考虑所设置的重复组的结果是

11、否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择为了保证结果准确，一般选择菌落数在菌落数在30300的平的平板上进行计数。板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三同一稀释度加到三个或三个以上的平板中个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。一、研究思路一、研究思路（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目（三）设置对照（三）设置对照主要目的是主要目的是排除实验

12、组中非测试因素对实验结果的影响，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度提高实验结果的可信度。1、判断培养基中是否有杂菌污染：、判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。2、判断选择培养基是否具有筛选作用：、判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（营养成分齐全）接种后培养，完全培养基（营养成分齐全）接种后培养， 观察菌落数目。观察菌落数目。一、研究思路一、研究思路（三）设置对照（三）设置对照以尿素为唯一以尿素为唯一氮源的培养基氮源的培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离分解尿分离分解尿素的细菌素的细菌判断该培

13、养基判断该培养基有无选择性有无选择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否接种是否接种目的目的结果结果只生长分解只生长分解尿素的细菌尿素的细菌生长生长多种微生物多种微生物是是组别组别实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，实验时，A同学从对应的同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出倍稀释的培养基中筛选出大约大约150个个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约选择出大约50个个菌落。分析其原因。菌落。分析其原因。原因分析：原因分析：（1）土样不同）土样不同（2）培养基污染或操作失误

14、）培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质）（或者是混入了其他的含氮物质）一、研究思路一、研究思路（三）设置对照（三）设置对照方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的同学存在操作失误或培养基的配制有问题。配制有问题。方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。行培养，作为空白对照，以证明培养

15、基是否受到污染。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。对照的设置是必不可少的。一、研究思路一、研究思路（三）设置对照（三）设置对照二、实验设计二、实验设计一土壤取样一土壤取样二样品的稀释二样品的稀释三微生物的培三微生物的培养与观察养与观察应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火程中，每一步都要在火焰旁进行焰旁进行分离不同的微生物分离不同的微生物采用不同的稀释度采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证

16、获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？量，选用的稀释范围相同吗？不同。不同。二样品的稀释二样品的稀释二、实验设计二、实验设计三微生物的培养与观察三微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需

17、要不同培养温度培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：细菌：3037培养培养12d 放线菌：放线菌：2528培养培养57d 霉菌：霉菌：2528的温度下培养的温度下培养34d。二、实验设计二、实验设计 一一 无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。要灭菌。2 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。旁操作。 二二 做好标记做

18、好标记注明培养基种类、培养日期、注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。平板培养样品的稀释度等。 三三 制定计划制定计划三、操作提示三、操作提示以尿素为唯一以尿素为唯一氮源的培养基氮源的培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素细菌尿素细菌判断该培养基判断该培养基有无选择性有无选择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否接种是否接种目的目的结果结果只生长只生长尿素细菌尿素细菌生长生长多种微生物多种微生物是是组别组别由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：较为宽泛的范围：稀释倍数为

19、稀释倍数为10103 310107 7。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释度下需要每个稀释度下需要3 3个选择培养基，个选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8 8个灭菌试管个灭菌试管和和1 1个灭菌移液管个灭菌移液管 。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了养基可以作为对照，用来判断选择培养

20、基是否起到了选择选择作用。作用。P251、通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏、通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2、 选择每个平板上长有选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的同一稀释倍数的三个重复的菌落数菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、结果分析与评价四、结果分析与

21、评价P261、在以、在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加为唯一氮源的培养基中加入入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如指示剂。培养某种细菌后，如果果pH升高升高，指示剂将，指示剂将变红变红，说明该细，说明该细菌能够分解尿素。菌能够分解尿素。 2、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水、测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养基培养基上培养，大肠杆菌上培养，大肠杆菌菌落呈现菌落呈现黑黑色色，通过记算得出水样，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。中大肠杆菌的数量。五、课题延伸五、课题延伸大肠杆菌呈黑色，中心有或

22、无金属光泽大肠杆菌呈黑色，中心有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂（EMBEMB）上典型特征）上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: :1、使用选择培养基的目的是（、使用选择培养基的目的是（ ） A. .培养细菌培养细菌 B. .培养真菌培养真菌 C. .使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D. .表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2、能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是、能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是（ ） A. .CO2和和N2 B. .葡萄糖和葡萄糖和NH3 C. .CO2和尿素和尿素D. .葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练CD3、下列说法不正确的是（、下列说法不正确的是（ ）A. .科学