结肠癌患者转录因子SnailmRNA和蛋白的表达及临床意义

1、结肠癌患者转录因子SnaiIniRNA和蛋白的表达及临床意义陆洪军王淑秋刘振平任翊华【摘要】目的探讨转录因子SnailmRXA和蛋白在结肠癌中的表达及临床意义。方式别离采纳RTPCR和Western印迹方式对68例结肠癌和20例正常结肠黏膜上皮组织进行SnailmRXA及其蛋白检测，分析该转录因子与结肠癌临床病理因素（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学分型、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes分期）的关系。结果在粘液癌（印戒细胞癌、粘液腺癌）、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于DukesC+D期的结肠癌中，SnailmRNA及其蛋白表达明显增高（P或，但与性别、年龄、肿瘤部位及大小

2、无关（P。结论Snail的表达与结肠癌侵袭、转移紧密相关；检测SnailmRXA及其蛋白对大肠癌的诊疗有必然价值。【关键词】结肠癌；Snail；侵袭；转移在肿瘤的生物学行为中，浸润和转移是最重要的特点，也是一些实质性肿瘤难以治愈的缘故。尽管外科手术医治、放射医治和化学医治日趋完善，但如何初期诊断，及时正确医治，抑制恶性肿瘤浸润和转移，提高患者的生存率己成为现今肿瘤防治的重要课题。研究证明，上皮间充质转化（epithelialmesenchymaltransitionEMT）是包括结肠癌在内的许多肿瘤细胞取得侵袭、转移能力的重要机制。转录因子Snail通过与Ecadherin启动子区的E盒（Eb

3、ox）结合，下调Ecadherin的表达，进而诱导EMT的发生，促使肿瘤细胞侵袭转移（Do本文旨在探讨转录因子Snail在结肠癌中的表达，以判定该转录因子在结肠癌侵袭、转移中的作用。1对象与方式对象2007年1月至2020年8月，在本院行根治性手术的大肠癌患者68例，男42例，女26例；年龄3275岁（中位年龄岁）；术中留取标本。所有病例术前均未同意化疗及放疗。肿瘤部位：左半结肠38例、右半结肠30例；肿瘤大小：W5cm者48例、5cm者20例。组织学分型：乳头状腺癌4例，管状腺癌48例，粘液腺癌11例，印戒细胞癌5例;分化程度：高分化腺癌24例,中分化腺癌30例，低分化腺癌14例；浸润深度：

4、未及浆膜层25例，浸及浆膜层43例；淋巴结转移：有转移18例，无转移50例；Dukes分期：A期32例，B期20例，C期11例，D期5例。另取20例结肠癌正常肠段的肠黏膜（经病理检查无异样）作对照。所用试剂为兔抗人Snail多克隆抗体（购自SantaCruz公司）;逆转录酶试剂盒（购自Promega公司）；Trizol试剂（购自美国宝生公司）。方式SnailmRNA检测按Trizol试剂盒说明提取总RNAo用紫外分光光度仪测定A260/A280,比值在之间，计算RNA含量。引物设计：（1）上游引物:5'AATCGGAAGCCTAACTACAG3'；下游引物：5'GGAA

5、CAGGCTGAAGTAGAG3'（扩增加度320bp）。（2）GAPDH：上游引物：5'ACCACAGTCCATGCCATCAC3'；下游引物：5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3,（扩增加度452bp,为内参照）。逆转录反映按试剂盒操作。RTPCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。Snail蛋白的检测Western印迹法。总蛋白提取：4搜集细胞，每孔加入100U1细胞裂解液（50mmol/LTrisHC1、150mmol/LNaCK5mmol/LEDTA1%NP4O、PMSF、2Ug/mlAprotinin、Ug/mlLeupeptin）,超声破碎

6、，412000r/min离心5min,搜集上清液。细胞核蛋白提取：参照文献方式（2,3）,略改动。蛋白质样品与等体积2义上样buffer混匀，煮沸5min,紫外分光光度计测定蛋白质浓度。按蛋白含量测定结果每孔上样50Ug,%SDSPAGE分离样品。低温100V3h将蛋白转至硝酸纤维膜上，用封锁液（5%脱脂奶粉、3%BSA.%Tween20溶于PBS）室温封锁2h,将膜与溶于封锁液中的一抗（兔抗人Snail多克隆抗体1：500）室温孵育2h,PBS洗5minX3次，TBS洗5minX4次，将膜与溶于二抗稀释液（5%脱脂奶粉、%Tween20、150mmol/LNaCK50mmol/LTrisHC

7、1,中的二抗室温孵育1h,TBS洗5minX4次，将膜装入可热接封的塑料袋中，加入ECL试剂，暗室曝光、显影、定影，对X光底片拍照保留。统计学处置所有数据均采纳x±s表示，应用统计软件对数据进行分析。各组SnailmRNA相对水平经方差齐性查验后采纳Studentt查验。2结果结肠癌组织SnailmRNA表达与临床病理因素的关系SnailmRNA在结肠癌中的表达水平与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关（P>,而与肿瘤浸润深度、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Dukes分期均有关。SnailmRNA在粘液癌（印成细胞癌、粘液腺癌）、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于DukesC+

8、D期的结肠癌组织中表达均明显增高（P,P。Snail与结肠癌肿瘤细胞的侵袭、转移紧密相关。见表1。表1结肠癌组织SnailmRXA表达指数与临床病理因素间的关系（略）结肠癌和癌旁组织SnailmRXA及其蛋白的表达结肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织中均有SnailmRNA表达,但与正常结肠上皮相较较，结肠癌SnailmRNA的表达升高（PV。见表2和图lo结肠癌SnailP30条带较正常对照组加宽加深，应用ChenImage软件计算蛋白平均灰度值，结果显示Snail蛋白表达与正常结肠上皮相较较，有显著不同（P。见表2和图2。表2结肠癌和癌旁正常肠黏膜组织中SnailmRNA及其蛋白的表达（略）3讨

9、论EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下向间充质细胞转化的现象，是许多肿瘤细胞取得侵袭、转移能力的重要机制（4）。EMT在个体胚胎发育、组织形成、伤口愈合和慢性炎症中，均发挥着重要作用（5）。研究证明，Snail参与了包括乳腺癌、胃癌和鳞状上皮细胞癌在内的某些肿瘤细胞发生EMT并增进其侵袭转移（68）。Snail可使细胞E钙黏素及a、B、Y连环素等上皮细胞标志物表达降低或消失，可表达到纤维细胞特异性蛋白一、N连环素等多种间充质细胞标志蛋白，且可增强肿瘤细胞侵袭和转移能力。在必然条件下逆转EMT表型时，就能够够降低肿瘤细胞的侵袭转移能力并延长荷瘤动物的生存期。Snail通过以下机制引发肿瘤侵

10、袭转移:作用于启动子上的Eboxes连接基序，直接抑制Ecadherin、claudins、occludins等上皮黏附位点成份的转录，使细胞间黏附紊乱；抑制ABLIM1、EPLIN等细胞骨架成份表达，使细胞骨架重组；增进基质金属蛋白酶表达，降解基质以增进细胞侵袭。研究证明，Snail引发的EMT在肿瘤转移进程中发挥重要作用，但不是惟一的，免疫抑制也起着必然作用。本研究说明：(1)结肠癌组织和癌旁正常组织SnailmRNA及其蛋白表达间存在不同：结肠癌组织SnailmRNA及其蛋白表达增加，提示Snail的高表达是结肠癌的发生、进展进程中的重要事件。(2)SnailmRXA及其蛋白的表达与组织

11、学类型、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、Dukes分期均有关：在粘液癌、低分化、侵及浆膜、有淋巴结转移和处于DukesC+D期的结肠癌中SnailmRXA及其蛋白表达明显升高，一样提示Snail的表达增加能够评判结肠癌的浸润、转移。【参考文献】1ShirakiharaT,SaitohM,MiyazonoregulationofepithelialandmesenchymalmarkersbydeltaEFlproteinsinepithelialmesenchymaltransitioninducedbyTGFbeta(J).MolBiolCell,2007;18(9)：353344.2

12、SamyTA,AyalaA,CataniaRA,ethemorrhageactivatessignaltransductionpathwaysinmousesplenicTcells(J).Shock,1998；9(6)：44350.3 DignamJD,LebovtzRM，RoedertranscriptioninitiationbyRNApolymeraseIIinasolubleextractfromisolatedmammaliannuclei(J).NucleicAcidsRes,1983；11(5)：147589.4 ThomsonS,BuckE,PettiF,ettomesenc

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14、ndslugplaydistinctrolesduringbreastcarcinomaprogression(J).ClinCancerRes,2006；12(18)：5395402.7 CastroAC,RosivatzE,SchottC,etisoverexpressedingastriccarcinomasandmayactsynergisticallywithSIP1andSnailinthedownregulationofEcadherin(J).JPathol,2007；211(5)：50715.8 UsamiY，SatakeS，NakayamaF,etassociatedepithelialmesenchymaltransitionpromotesoesopha